실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
sds-page 전기영동 결과 조언 부탁드립니다
레벨3 솔로몬이꿈 (대학원생)
- 등록일 2023.06.05 12:08:08
- 조회1550
안녕하세요. 석사 1학기차 학생입니다.
제 target peptide를 Ni-NTA resin으로 정제 후 16% gel로 sds-page로 정제를 확인해보니 정제 전에 발현을 확인했을 때는 아래 사진과 같이 잘 발현이 되었습니다.
이후 사정상 1달 가까이 sample을 냉장보관해두면서
8M urea로 insoluble한 제 target peptide를 solubilization 및 정제를 진행하고 다시 sds-page를 내려보니 다음과 같이 앞서 나온 분자량보다 더 작은 분자량에서 단백질이 확인되었습니다.
Ni-NTA purification은 다음과 같이 진행했습니다.
open column에서 resin을 하루 전에 5mL정도 packing해서 냉장보관한 후,
1. resin 보관용액인 20% EtOH 제거
2. lysis buffer(8M urea, 20mM Tris, 500mM NaCl, 10mM imidazole) 25mL 주입 후 제거
3. column 출구를 막고 sample 15mL 주입 후 5분간 정치
4. unbound fraction 받기
5. washing buffer(8M urea, 20mM Tris, 500mM NaCl, 20mM imidazole) 20mL 주입
6. washing fraction 받기
7. elution buffer(8M urea, 20mM Tris, 500mM NaCl, 250mM imidazole) 25mL 주입
8. elution fraction받기
결과 상 문제점으로는
1. sds-page 결과를 보면 unbound wash elution에서 모두 제 target peptide가 용출된 점
2. target peptide의 크기가 달라진 점
이렇게 크게 2가지 인 것 같습니다.
생각하는 원인으로는 insoluble 을 보면 band가 2개가 나온 걸로 보아
장기간(거의 1달간) sample을 냉장보관해서 단백질이 불활성화되면서 저분자화되었다.
정도입니다.
왜 제 target 단백질 크기가 작게 나왔는지 궁금하고
현재 protocol을 찾고 있는 중이긴 한데 제 open column에서 정제 시 개선할 점 조언부탁드립니다!
감사합니다!
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