300kDa 이상 단백질, REV3L western blot band 확인 관련 질문 드립니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q 300kDa 이상 단백질, REV3L western blot band 확인 관련 질문 드립니다.

레벨02 가나다라다나가 (대학원생)

23.06.05 10:23
조회2358

안녕하세요.

석사 과정 중에 있는 대학원생입니다.

7% gel에서 stacking 30분, seperating 30분 총 1시간 전기영동하고,

PVDF membrane에서 350kDa 사이즈의 REV3L의 웨스턴블롯 밴드를 보려고 하는데 잘 되지가 않아서 문의드립니다.

저희 연구실에서 이전에 사이즈 300 정도 되는 단백질을 transfer 390mA / 6hr 조건에서 band 본 적이 있다고 해서 같은 조건으로 해보았는데 밴드가 나오질 않습니다.

그래서

- 1차 항체 붙이는 시간을 기존 RT, 1hr -> 2hr로 더 길게 붙이고,

- BSA 농도도 기존 3% -> 0.5% 농도로 낮추어서도 해보았는데 밴드가 안 나옵니다..

혹시 REV3L band 보셨거나, REV3L이 아니어도 300 이상 단백질의 band를 보신 선생님 계시면 관련 조언 부탁드리겠습니다.

감사합니다.

Mol. Biol.-Protein > Western Blot

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A 답변 5

레벨01 .. (비회원)
23.06.05 10:49

western blot 자체에 대한 positive control과

해당 항체 activity를 확인할 수 있는 positive control이 있나요?

답변리플

레벨02 가나다라다나가
23.06.05 11:11
질문자

작성자입니다.

관심과 답변에 먼저 감사드립니다.

western blot control은 Lamin으로 잡는데 Lamin band에는 문제가 없습니다.

그 외 다른 단백질도 같이 보는데 그 단백질들 band에도 문제가 없습니다.

정확히 쓰자면 REV3L 항체 붙인 membrane에서 밴드가 쭉 끌린 자국이 있는데, 그게 350부터가 아니고 300 마커부터 250마커 정도까지 끌린 자국이 있습니다. 혹시 몰라서 300마커 윗부분 젤은 자르지 않고 충분히 남겨두었는데도요..

그리고, 항체 activity를 보기 위한 positive control이라는 것이 어떤 의미인지 제가 잘 모르겠어서 설명해주시면 감사하겠습니다.

저도 항체가 잘 기능하고 있는건지가 궁금합니다..

혹시 이 내용으로 답변이 될까요? REV3L band 잡히는지부터 확인해보기 위해서 어떤 실험 처리한 cell이 아닌, normal cell로 harvest 해서 한 실험입니다.

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨01 .. (비회원)
23.06.05 13:47

기본적인 trasnfer 여부는 marker로 확인이 가능합니다.

300kDa marker가 정상적으로 transfer 되었다면 350kDa의 단백질이 transfer 되지 않았다고 보기는 어렵다고 생각합니다.

transfer와 WB 방법에 문제가 없다면 항체 활성 확인이 필요합니다.

항체 활성을 확인할 수 있는 근거가 없다면, target protein이 없는 것인지, 있지만 detection이 안 된 것인지 판단할 수 없습니다.

직접적으로는 정제된 REV3L 단백질이나, 다른 실험에 해당 항체를 이용하여 확인된 결과가 있는지를 여쭌 것인데, 말씀하신 내용을 보면 없는 것 같습니다.

제가 직접적으로 이 쪽 분야 실험을 진행하진 않아서 도움이 될 진 모르겠습니다만, 계속 실험이 안 되고 방법을 찾기가 어려우시다면, FLAG-tag 혹은 HA-tag 등을 conjugation한 REV3L DNA를 transfection하여 발현시킨 후에 anti-FLAG(or HA)과 anti-REV3L 항체를 사용하여 비교해볼 수 있겠습니다.

혹은 (이론적으로 생각만 해 보고 실제 실험은 안 해봤으나) Anti-REV3L의 Antigen peptide sequence를 합성하거나 E.coli에서 발현시켜 (insoluble해도 상관 없음) 항체 활성을 확인해보는 방법도 있겠습니다.