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Q Western blot 초보입니다. 몇 가지 질문 드립니다.

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레벨03 Brady (대학원생)

  • 23.06.01 13:32
  • 조회3532

upload_image

1. p-mtor (289kd) 밴드가 나오지 않아서 ponceau를 해보았습니다.

해당 위치에서 밴드가보이지 않는 것 같은데, 그렇다면 transfer가 잘 되지 않아서 밴드가 잡히지 않는 걸까요?

 

2. ponceau 사진상의 얼룩들은 기포 때문일까요? 그렇다면 눈에 보이지 않는 잔기포를 없애는 방법은 어떤 게 있을가요?

upload_image

3. GAPDH 밴드(아래쪽) 를 확인하였는데, 비특이 band(위쪽)가 많이 나타납니다. 원래 이러한 현상이 나타나나요?  SC사 mab 1 :5000으로 진행했습니다.

비특이 band 위치가 제가 보려는 단백질들 위치인데, 항체를 사용하지 않아도 나타나서 당황스럽네요ㅠ

blocking buffer는 biosesang 사 제품 사용 중입니다.

skim milk 고려해보고 있습니다.

 

도와주시면 감사드리겠습니다!

 

 

Mol. Biol.-Protein > Western Blot

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답변등록

A 답변 4

  • 레벨01 도비n년째
  • 23.06.02 19:59
안녕하세요 일단… 내릴때 너무 저항이 세거나 기타 다른 이유로 밴드가 울어버린것 같구요… 이 안티바디는 정말 여러번 재실험해야 결과를 겨우 하나 건집니다. 잔기포는 transfer 하면서 들어가고 이거는 transfer buffer 묻혀가며 쭉쭉 밀어서 겔 찢어지지 않게 밀어주는 수밖에 없습니다. blocking은 phospho form 보는 경우 skim milk 로 썼다가 리뷰어한테 극딜 먹었고 지금 저희 랩은 BSA 사용합니다
  • 레벨01 뭐지뭐지
  • 23.06.05 23:32

올려주신 사진이 보이지 않아서, 제대로 된 답변이 될지 모르겠습니다.

 

1. 폰슈 처리에 의해서 큰사이즈 (300kda)부분에서 band 또는 끌림 현상이 보여지지 않는다면, transfer 문제가 맞아 보입니다.

transfer 조건들을 몇가지 변경해 볼 수 있습니다. 

Wet transfer를 하신다면, 60 - 80V, 250mA 정도로 1-2시간 transfer를 수행하실 것 같은데,

1) 20-25V로 낮춰서 overnight transfer를 해볼 수 있습니다.

2) transfer buffer에서 메탄올 없이 진행하면 큰 사이즈가 더 잘 transfer 된다고 알려져 있습니다.

3) transfer buffer에 SDS를 소량 첨가하여 사용할 수 있습니다.

 

2. 사진이 안보여서.. 

원형으로 나온다면 기포 때문일 가능성이 높고,

번져서 생긴 문제이면, 

장갑이 오염되었거나, PVDF membrane의 활성화가 덜 되었거나, membrane-gel을 카세트에 넣을때 membrane이나 gel이 울었을 가능성이 있습니다. 

사진이 보이지 않아 짐작만 해 봅니다.

 

3. western blot blocking solution 판매하는 제품들 중, 짧은 시간에 깨끗하게 blcoking을 진행할 수 있는 제품들이 blocking이 약한 경우가 종종 있습니다.

(제품의 품질을 이야기하는 것이 아닙니다, 예를들면 동일한 g/vol 으로 %를 설정하면 BSA보다 skim milk가 더 강하게 blocking 됩니다.)

blocking solution을 변경해보시길 추천드립니다.

일반적으로 BSA를 많이 사용하며, FBS, NBCS 등을 대신하여 사용할 수 있습니다.

GAPDH는 흔히 사용하는 positive control 이어서 큰 문제는 없지만,

항체 구매 회사를 바꿔보거나, positive control을 다른 것으로 사용해 보는 것도 방법이 될 수 있습니다.

 

좋은 결과 있으시길 바라며.

 

  • 레벨03 Brady
  • 23.06.06 12:45
  • 질문자

사진이 갑자기 안보이네요 ㅠ

사진 첨부합니다 답변 정말 감사드립니다!!!

Western blot 초보입니다. 몇 가지 질문 드립니다.
  • 레벨03 Brady
  • 23.06.06 12:45
  • 질문자

아래쪽이 GAPDH이고 위쪽 큼지막한 게 비특이 band입니다!

Western blot 초보입니다. 몇 가지 질문 드립니다.

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