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레벨4
CHM91
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2023.05.31 19:13
loading buffer의 dye를 보니 product가 3, 6, 8, 10번 lane에 들어가 있는것으로 보이네요. 안쪽 네번째라고 하셨으니 10번 lane의 band에 대하 질문이라고 생각하고 답변드리겠습니다.
우선 DNA ladder의 band는 확실하게 관찰이 가능합니다. 또한 8번 lane의 band는 확실히 관찰이 가능합니다. 이는 전기영동이 잘못되었을 가능성은 낮을 수 있다는 것을 의미합니다.
다만, 한가지 신경쓰이는 점은 6번lane에서 시작되어 11번 lane까지 있는 얼룩입니다. 얼룩의 정체가 이미징챔버의 바닥에 있는 얼룩인지, 아니면 gel에 있는 얼룩인지가 중요합니다. gel에 있는 얼룩이라면 gel이 잘못만들어졌을 수 있습니다. agarose가 확실히 녹지않은 상태에서 gel을 굳히면 gel이 불균일하게 만들어져 DNA가 걸리지 않는 등의 에러가 발생할 수 있습니다.
gel에 문제가 없을 경우 PCR에 의한 증폭이 제대로 되지 않았을 수 있습니다.
1. Gel을 처음부터 다시 제작하여 동일한 product로 전기영동을 진행
2. PCR을 다시 시행
으로 확인할 수 있습니다.
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레벨1
Biology123
(대학생)
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2023.05.31 19:24
답변 감사합니다!!! 그런데 100보다 크니까 PCR 된 것 아닌가요? 만약 그냥 Primer만 있다면 아래로 밴드가 더 진행했을건데 그게 아니니까...
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레벨4
CHM91
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2023.05.31 19:44
PCR product의 예상 사이즈는 어느정도였나요
저 band가 product band라고 한다면 약100bp정도의 사이즈인데 예상한 사이즈가 맞나요?
PCR product의 예상사이즈가 100bp정도였을경우.
100bp의 PCR product를 보기에는 1% agarose gel은 너무 연합니다. 200bp이하의 product를 위해서는 agarose gel의 농도를 올리는 것이 좋습니다.
예상 사이즈가 100bp가 아닌경우.
1% agarose gel에서 약 30~50bp에 해당하는 primer dimer와 100bp ladder band와의 차이는 그리 크지 않습니다. 또한 전기영동을 약간 일찍 끝낸감이 없지않아 있어 조금더 전기영동을 진행했다면 더 정확하게 확인이 가능했을 수 있습니다.
non-specific band일 가능성도 있습니다만, PCR을 재진행해야한다는 점에서는 변함이 없습니다.
Specific product가 아닌 random product가 예상되는 경우.
혹시나 한쪽 primer를 universal primer를 사용하여 random하게 pcr을 진행한 경우, 저 밴드에 다수의 band가 섞여있을 수 있습니다. 이는 동일한 product를 사용하여 더 높은 농도의 agarose gel에 전기영동을 하면 분리할 수 있습니다.
(저는 80bp, 120bp, 180bp, 250bp product를 나누기위해 4% agarose gel을 사용한 적이 있습니다.)
