실험 Q&A Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
Annexin V Assay cell aggregation이 되는 것 같은데 어느 단계에 문제가 있나요...?
레벨1 물먹는하마 (대학원생)
- 등록일 2023.05.31 18:31:03
- 조회972
안녕하세요
화학과에서 유튜브랑 구글에 의지해서 새로운 실험을 셋팅하는 대학원생입니다...
이번에 Annexin V Assay를 처음 하였는데요
샘플 준비까지 아무 문제 없다가 FACS 찍으러 가서 PBS를 200uL 넣었을 때 cell이 aggregation 되는 것 같이 보였습니다.
주변에 물어보았으나 이유를 모르거나 이 실험을 해본적이 없다고 하여 브릭에 여쭤봅니다 ㅠ
Protocol
- The A549 cells (2.0 × 105) seeding in plate followed by overnight incubation at 37 °C.
( 6 control: non-treated cell, FITC treated cell, PI treated cell, FITC/PI treated cell X3)
- (PBS로 씻은 후 ) Treat Drugs with different concentrations for 24 h.
- Then, the cells were collected (trypsin 200 μL per well, 1 min, 600 x g centrifuge), resuspend with cold 1X PBS and 600 x g centrifuge.
- Cells were diluted in 1× annexin-binding buffer to about 1 × 106 cells/mL
- Add 5 μL of fluorochrome-conjugated Annexin V to 100 μL of the cell suspension.
- Incubate 15 minutes at room temperature. Protect from light.
- Add 1 mL 1X binding buffer and centrifuge at 600 x g for 5 minutes at room temperature. Discard supernatant.
- Resuspend cells in 200 µL of 1X binding buffer.
- Add 5 μL of Propidium Iodide Staining Solution Viability Staining Solution and incubate 15 minutes on ice or at room temperature.
- Apoptotic cells were analyzed by a flow cytometer (BD FACSCanto II).
+ 찍으러가서 FACS용 tube에 200uL 필터 후 vortex하고 PBS 200uL 넣으면 cell이 aggregation 되는 것 같이 보입니다.
* 10X binding buffer 레시피
: 0.1M HEPES, 1.4M NaCl, 25mM CaCl2 in D.W.
pH를 안 맞추고 했었는데 지금 재보니 7.19 입니다
*Dye: FITC/PI cat.88-8005-72
Invitrogen™ eBioscience™ Annexin V Apoptosis Detection Kits
어느 단계에서 문제가 있는거 같나요ㅜㅜ
#Annexin V
#Apoptosis
#cell aggregation
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