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Apoptotic cell staining (TUNEL) 과정에서 발생하는 cell loss 관련 질문드립니다.

레벨1 CNHJ (대학원생)

안녕하세요, 석사과정 반년차 대학원생입니다.

실험 중 세포 control 과정에서 생기는 cell loss와 관련하여 질문이 있어 글을 남기게 되었습니다..ㅜㅜ

현재 5-70% 정도의 세포사멸을 유도한 cell을 AnnexinV-Kit와 TUNEL-kit로 각각 staining하여 facs로 분석하는 실험을 진행하고 있습니다.

그런데 같은 양의 세포를 컨트롤 하더라도 Protocol step이 보다 간결한 Annexin 실험의 경우 staining후 facs로 분석하기에 충분한 양의 세포가 남는 것에 반해,

TUNEL의 경우 Cell fixation (wash 과정 포함) + Cell staining (wash 과정 포함) 두 과정으로 나뉘고, Annexin에 비해 wash step도 더 많아서인지 cell loss가 많이 발생하고 있어서 고민입니다.

wash하고 centrifuge 돌리는 step이 많아서 그런 것 같은데, 이 부분을 극복하기 위해 상층액을 제거 할 때도 석션기를 안쓰고 파이펫으로 살살 떠냈거든요. 그럼에도 남는 cell이 많지 않아 고민입니다.

(처음부터 세포를 burk로 키우고 drug을 처리하여 많은 양의 세포를 핸들링하는 방법도 있겠지만, kit protocol이 명시하고 있는 세포 농도가 정해져 있고, kit assay 횟수도 이에 맞춰져 있어 이 부분은 고려하기 어려운 상황입니다.)

그렇다고 wash step을 줄이거나 대충하고 넘기기엔 staining(효소반응 등)이 제대로 이루어지지 않을 까봐 염려가 되어서요..

현재 생각해둔 해결 방안으로는 g-force를 높여서 최대한 많은 양의 세포가 모일 수 있도록 유도하려고 하는 것인데요,

세포 종류는 Jurkat cell이고, cell maintain 할 땐 150g x 5 min으로 centri하고 있습니다.

TUNEL kit 상 안내된 g-force가 300g x 5 min이어서 이전 실험에서는 이렇게 진행하였구요.

해당 세포나 관련 실험에서 cell loss를 줄이기 위해 어떠한 방법들을 고려하셨는지, 선배님들의 조언을 구하고자 합니다.

그럼 다들 하시는 실험 모두 잘 되시길 바라며, 답변 주시면 감사드리겠습니다 : )

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