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웨스턴 밴드가 너무 얇습니다

레벨2 브르르르릭 (대학원생)

등록일 2023.05.30 17:56:05
조회1476

IMG_4685.png (다운로드 : 106) 첨부파일다운로드

안녕하세요. 현재 웨스턴블랏으로 고생하고 있는 대학원생입니다

웨스턴 블랏을 처음 해보는거라서 고생좀 많이 했는데
이제 밴드가 나오긴 해도 너무 얇게 나오네요…

사진에서 왼쪽부터 3개는 20ug, 4번째는 30, 5번째 40, 6-7번째는 20ug 단백질을 넣는겁니다 

단백질 양이 많진않아서 30,40을 제외하곤 loading volume을 25uL로 맞춰서 5X sample buffer 5uL 나머지 sample protein과 DW로 넣었고요

오늘 내려보니까 30과 40을 넣은 well은 전기영동때부터 끌리면서 내려오더라고요
이쁘게 끌린것도 아니고 그냥 뒤죽박죽으로 끌려내려왔어요
밴드를 찍어봐도 4,5번째는 밴드가 다른거에 비해 두껍지도 않네요

근데 그건 제 생각엔 단백질 양에비해 sample buffer가 적었을 가능성을 생각하고 있긴합니다
아마 well쪽에서 걸려서 나머지가 못내려온건지…

아무튼 그것도 문제지만 더 문제는 저 밴드들이 너무 얇다는 것입니다
다른 논문들 보면 밴드가 적당히 두껍게 다 이쁘게 나오는데 저는 뭐 둘이 비교하지도 못할꺼같네요…

단백질양이 부족한걸까요?

우선 제가 하고 있는 protocol을 간략히 써드리겠습니다

SDS PAGE 150V 1시간30분
Transfer 350mA 1시간20분
5% skim milk TBST blocking 1시간
primary 1:1000 1시간
wash 10분 3번
second 1:1000 1시간
wash 10분 3번
ECL 1분
측정 기계로 15분간 찍습니다

문제점들로는
1. 밴드가 얇은것
2. 전에 안보이던 non-specific binding이 보인다는 것 (항체 dilution 농도는 전과 같이 했는데 갑자기 보입니다)
3. membrane을 보면 모든 밴드에 끌림현상이 보인다는 것
4. protein을 30ug이상으로 well에 넣으면 이상하게 끌리면서 내려온다는것
5. 오른쪽에 뭔지모를 이상한 검정색

이정도입니다
제 생각엔 밴드가 얇은건 프로틴 양을 늘리면 되겠지만 늘리게 되면 4번과 같이 끌리는 현상이 있다는 겁니다
그렇다고 항체를 더 세게 하기에는 이미 non-specific binding이 보여서 그렇게 할 수는 없을꺼같고요

어떻게 고쳐나가면 좋을까요
조언 부탁드리겠습니다

#western blot
#protein

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답변 4

답변등록

레벨1 달성
2023.05.30 18:17

<p>문제점이라고 생각하는 것에 대해 제 생각을 적어 봅니다.</p>

<p>1. 밴드가 얇은것</p>

<p>밴드가 얇은 건 딱히 문제가 되지 않습니다. 보실려고 하시는 protein에 따라 얇게 나올 수도 있으니까요. 로딩이 잘 되었나 확인해 보실려면 housekeeping gene(actin)을 로딩해 보면 잘 알 수 있을 겁니다.</p>

<p>2. 전에 안보이던 non-specific binding이 보인다는 것 (항체 dilution 농도는 전과 같이 했는데 갑자기 보입니다)</p>

<p>antibody에 따라서 그럴 수 있습니다. monoclone이 아니면 일반적인 겁니다.&nbsp;</p>

<p>저희가 protein marker를 로딩하는 하는 이유도&nbsp;저희가 알고 싶은 protein의&nbsp;&nbsp;molecule weight를 확인해서 매칭하는&nbsp;이유이기도 하기도 하구요.&nbsp;</p>

<p>&nbsp;</p>

<p>3. membrane을 보면 모든 밴드에 끌림현상이 보인다는 것</p>

<p>끌림 현상이 어떤 것을 말하는지 모르겠지만 빈 웰이 있으면 가끔 웨이브를 타는 거처럼&nbsp; 로딩이 될 수 있습니다.</p>

<p>4. protein을 30ug이상으로 well에 넣으면 이상하게 끌리면서 내려온다는것</p>

<p>볼티지를 낮춰서 진행보시면 될 것 같네요.</p>

<p>5. 오른쪽에 뭔지모를 이상한 검정색 이정도입니다</p>

<p>저건 ECL를 너무 많이 넣어서 그쪽에 남아 있는 게 검정색으로 나온 것 같네요</p>

레벨2 브르르르릭 (대학원생)
2023.05.30 18:37

답변 정말 감사합니다! 
<br>한가지 추가 질문이 있다면 4번에 대한 답변으로 볼티지를 줄이면 괜찮을꺼 같다고 하셨는데
<br>그럼 sample buffer에는 문제가 없었던걸까요? 
<br>4,5번째는 다른 well에 비해 더 많이 넣어줬는데도 밴드가 똑같이 나오는걸 보면 well위에 부분에 걸려있다고 생각해도 되는건가요?

레벨1 달성
2023.05.30 21:11

채택답변
질문자가 채택한 답변입니다.

<p>그럼 sample buffer에는 문제가 없었던걸까요?</p>

<p>쓰시는 sample buffer(2X,4X, 5X)에 대해&nbsp; 그에 맞게&nbsp;희석만 잘 해서 사용하시면 보통은 몇년이 지난 버퍼를 사용해도 문제 없이 잘 나옵니다.</p>

<p>4,5번째는 다른 well에 비해 더 많이 넣어줬는데도 밴드가 똑같이 나오는걸 보면 well위에 부분에 걸려있다고 생각해도 되는건가요?</p>

<p>well 위에 걸려 있다면 디텍팅 하였을때 위쪽에도 검은색 밴드 같은 것이 보이겠죠.</p>

<p>웨스턴 전기연동 이유가 각 프로테인을 각 연동시켜 분자량에 따라 나누고 저희가 원하는 안티바디를 붙여 확인하는데 있죠.</p>

<p>전기연동이 잘 못 되어서 원하는 프로테인이 well에 남아있으면 거기에 밴드가 형성 되겠죠.</p>

<p>보통은 낮은 볼트 60V정도로 30분 정도 연동시키면 stacking gel에서 각 well에&nbsp;프로테인이 농축되어 동일선 상이 되고 그 다음 볼트를 올리면&nbsp;running gel에서 각각 프로테인들이 분자량에 맞게 분류되죠.&nbsp;</p>

<p>끌림 현상은 같은 선상에 오기 전에 볼트를 올려서 그럴 수도 있고 전기영동장치 자체적인 문제 일 수 있습니다.</p>

<p>생각보다 연동장치 전선부분이 쉽게 손상되는 그쪽에 이상인 없는지도 확인해 보는게 좋을 듯 합니다.</p>

<p>계속 해서 문제가 생긴다면 gel %를 낮게 해서 확인해 보시거나 전기연동장치&nbsp;</p>

<p>자체적으로 문제일 수도 있으니 다른 장치로 확인해 보세요</p>

<p>&nbsp;</p>

<p>&nbsp;</p>

<p>&nbsp;</p>

레벨2 브르르르릭 (대학원생)
2023.05.30 21:41

감사합니다! 제가 well쪽 부분 젤은 잘라내고 제 프로틴 크기
<br>위치 부분만 찍어낸것이어서 위쪽에 남아있는지는 확인할수가 없었네요..
<br>
<br>저희 랩이 precast gel을 사용해서 바로 처음부터 150V를 내렸지만 다음부터는 한번 60볼트같이 낮은 세기로 내렸다가 올려봐야겠네요

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