-
레벨5
Eigen
-
2023.05.28 16:08
좀 더 자세히 적어주세요...
Lentivirus transfection & infection 했는데 실패했습니다. 무엇이 문제죠?
이 정도인데 어떻게 대답해야 할까요?
-
레벨5
Eigen
-
2023.05.28 16:11
K.O와 달리
KD의 경우 같은 gene 내에서 어떤 target sequence를 선택했느냐에 따라
Knockdown 효율이 차이가 나긴 합니다
-
레벨2
호라칼라
(대학원생)
-
2023.05.28 17:29
자세하게 질문드리지 못한 점 죄송합니다 우선 박테리아를 통해 원하는 dna를 얻고, 그 dna를 많이 뽑아서 (KO dna) 293FT Cell을 통해 lipofectamin 2000 을 이용해서 trnasfection을 시키구요 저희 실험실이 transfection 한 다음 2day 동안 incubation 시켜준다음 LV concentration 시켜준다음에 하루동안 cold room에서 over night 시켜준 다음 cancer cell에 infection 시켜주는 이러한 protocol을 사용하고 있습니다. 그래서 최종적으로 cancer cell에 infection 된 cell을 얻게 되는 겁니다. 그런데 이 cell line 자체가 expression test에서 전혀 Knock down 혹은 Knock out 된 경향성이 안보입니다. rna level에서는 어느정도 감소하는 경향성이 보이긴 하지만 protein level에서는 전혀 확인이 안됩니다. 이말인 즉슨 control에 비해 제가 원하는 sample이 전혀 발현이 줄어들지 않는다는 거에요. 그래서 LV 실험 조건도 변경시켜보고 selection 도 해보고 여러가지 방법을 다 해봐도 expression에서 전혀 줄어드는 경향성을 파악할 수 없습니다. 제가 그래서 너무나 답답한거에요 어떻게 해야할지 갈피를 전혀 못잡겠습니다. infection 실험 당시에 제가 filter tip을 사용하지 않아서 LV sup이 제대로 걷어지지 않은건지, 아니면 애초에 dna 자체가 infection 효율이 안좋아서 자체적으로 expression 에서 경향성을 파악할 수 없는건지를 모르겠습니다.
주저리주저리 말이 길었지만 하여튼 Knock out stable cell line을 하루빨리 만들고 싶은데 지금 3달째 진전이 없는 상태입니다. 이 상태를 빨리 끝내고 싶어 하루하루가 너무 힘든 상황인데, 어떻게 제가 이 사태를 해결해야할지 모르겠습니다. 도와주신다면 감사하겠습니다.
-
레벨5
Eigen
-
2023.05.28 17:46
일단 lentiviral shRNA Knockdown이라고 생각하고 말씀드리겠습니다.
가능성 1) Lentivirus가 제대로 만들어지지 않았다.
lentiviral packaging vector와 envelope vector에 대한 언급이 없는데, HEK293FT에 shRNA plasmid transfection 할 때 같이 사용한 것이 맞나요?
가능성 2) viral titer가 낮거나 모종의 이유로 소수의 cancer cell에만 infection 되었다. selection 과정으로 infected cells만 선별한다.
-> puromycin이나 blasticidin s 같은 drug selection 과정이나 GFP 발현여부로 selection 과정이 써있지 않았는데, selection 했는지?
가능성 3) shRNA target sequence 자체가 inefficient함
-> target sequence를 바꿈
가능성 4) lentivirus 및 shRNA target sequence에는 문제가 없으나 (다른 cell line에선 잘 working한다면), 해당 cancer cell 자체가 원래 lentiviral transduction이 잘 안되는 cell line이다. (특히 immune cell 이라면)
-
ssss
(비회원)
-
2023.05.31 13:51
실험에 제일 중요한 positive control이 빠졌습니다.
* lentivirus가 잘 만들어졌는가?
* lentivirus shNT-GFP 가 필요합니다.
(이 shNT가 없다면 형광이 발현되는 lentivirus로 써도 무방합니다)
내가 만드는 lentivirus가 잘만들어졌는지에 대한 positive control로 사용해서
infection 할때 concentrator를 써서 농축하는지 media 상태로 incubation 하는지 모르겠으나, infection 하는 바이러스 양을 달리해서 cancer cell에서 GFP가 발현이 잘되는 바이러스 titration을 잡아야 합니다.
이 문제가 해결이 된다음 Knock out 효율을 비교해야
knockout sequence가 문제인지 아닌지 파악할 수 있습니다.
selection을 하는 경우 negative control로 infection 하지 않은 세포도 함께 selection 진행을 해서 항생제에 의하여 모두 죽는 농도까지 selection을 진행해야 합니다.
실험을 결론을 내리기 위해서는 각 스텝마다 실험이 잘 진행되었는가에 대한 지표가 필요하니, 꼭 명심해서 진행하세요
