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Bacillus 그람염색이 유난히 잘 안되는 이유 질문드립니다.

레벨1 boulardii (대학생)

등록일 2023.05.26 15:36:12
조회1347

QC 인턴 중이고 Bacillus subtilis을 다른 균주(Clostridium, Enterococcus)와 함께 주기적으로 그람염색 시험 중에 있습니다. 그런데 Bacillus subtilis의 그람양성 반응이 특히 잘 보이지 않더라고요(false-negative). Safranin 때문에 대부분 갈색으로 보입니다. 현재는 슬라이드글라스에서 억지로 염색이 잘 된 부분을 찾아서 증거사진을 남기고 있습니다.

배양조건은 3종 모두 37도 2일 배양이며 B.subtilis는 전분한천배지에 키웁니다. 하루 배양 후 그람염색을 시도해봐도 이상적인 결과가 나오진 않았습니다. Bacillus가 그람양성 대조군으로 쓰이는 걸 보면 염색이 잘 나와야 할텐데 왜 이럴까요...

슬라이드글라스에 D.W. 한 방울 떨어뜨리고 colony 따서 희석>>알코올 램프 열고정>>크리스탈 바이올렛 1분>>Lugol solution 1분>>ethanol 10초>>Safranin 30초

순서로 그람염색 하고 있습니다.

#Bacillus
#그람염색
#false-negative

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답변 6

답변등록

레벨8 SPEED
2023.05.27 19:52

1. Bacillus가 특별히 염색이 잘 안되는 균이 아닙니다.

2. 다른 G(+)균과 동시에 염색해도 결과가 잘 안나오나요?

3. 혹시 염색이 잘 안된 사진있나요?

레벨1 boulardii (대학생)
2023.05.30 13:07

Rich Davis, PhD, D(ABMM), MLS 🇺🇦 on Twitter: "4) As mentioned, the decolorization issue seen with Bacillus and Clostridium often happens with older cultures. This Bacillus subtilis group was unique in that

잘 나온 사진만 보관하다 보니 인터넷으로 최대한 비슷한 사진을 찾았습니다. 위의 사진보다 살짝 어둡게 나오는 편이고 이런 결과물이 나왔을 때 그람양성이라는 설득력이 부족하다고 생각됩니다.

다른 균이랑 같이 (물론 다른 슬라이드에) 실험해봐도 B.subtilis가 심한 편이네요. 여러 논문을 찾고는 있는데 B.subtilis가 gram-negative-like PG layer를 형성할 수 있다고 해서 더 알아보는 중입니다...

레벨8 SPEED
2023.05.30 15:23

- 실제 실험한 사진이 필요합니다만. 판단하기가 힘드네요.

asdf (비회원)
2023.05.30 16:29

채택답변
질문자가 채택한 답변입니다.

에탄올 처리 후에 탈색 된 상태인지, 보라색 그대로 있는지 확인해보셔요

1. 탈색되었으면 크리스탈 바이올렛-아이오딘 중합체가 펩티도 글리칸 층에 남아있지 않은겁니다. colony 따서 PBS-centri wash 2회정도 한 pellet으로 다시해보셔요. bacillus subtilis는 세포 외부로 점액성물질을 내뿜습니다. 이 점액성 물질이 그람염색에 영향을 줄 가능성이 없잖아 있어요

2. 탈색 안되어있으면.. 사프라닌이 너무 진하거나 형광현미경의 광원으로 인해 붉게 보일수도있구요. 근데 유독 bacillus subtilis만 붉게 나온다 하니 위 확률은 낮겠네요

레벨1 boulardii (대학생)
2023.05.31 17:29

upload_image

이런 식으로 나옵니다.

B.subtilis가 내는 점액이 그람염색을 방해한다는 발상을 못하고 있었네요. 조만간 원심분리로 wash 시도해보겠습니다. 에탄올 세척 후에도 색은 남아있으며 다만 Lugol 용액 처리 후 보라색이 검은색으로 바뀌는 현상은 있습니다. 감사합니다

레벨1 boulardii (대학생)
2023.06.20 10:03

위의 두 분 모두 감사합니다.

Bacillus subtilis를 키웠던 배지 문제였던 것 같습니다.

전분한천배지에 키웠었는데 확실하진 않지만 그람염색을 하면서 Lugol solution이 전분 성분과 반응해서 색이 갈색으로 나온 것 같아요

덕분에 해결에 도움이 되었습니다.

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