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yeast transformation관련해서 질문드립니다.

레벨2 oliving (대학원생)

등록일 2023.05.26 14:29:03
조회1054

최근에 Y2H를 위해서 yeast transformation을 하고 있습니다.

electroporation을 사용해서 2가지 DNA를 넣고있는데 분명 방법은 간단한데 효율이 문제가 아니라 애초에 colony조차 안나오네요

여러가지 해결법을 찾아보다가 의문이 들어서 질문남깁니다.

electroporation원리상 세포막이 느슨해지면서 플라스미드가 들어가는걸로 알고있는데 그러면 기존에 들어가있던 플라스미드가 다시 나올경우는 없는건가요.

그리고 현재 plate에서 선별된 colony를 이용해서 transformation을 하는데 이럴경우 기존 competent cell을 만들어서 transformation하는 방법과는 다르게 봐야되는게 맞을까요

교수님께 나름 트러블슈팅 해서 갔는데 그건 컴셀이용해서 할때는방법이라고 하셔서 두개를 다르게봐야되는지 의문이 생겼습니다.

아직 지식이 부족한 대학원생에게 가르침을... ㅠ

#yeast
#transformation

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답변 1

답변등록

레벨5 밍고
2023.05.31 01:31

채택답변
질문자가 채택한 답변입니다.

저는 electroporation 방법으로 transformation하지는 않고 PEG heat shock 방법을 주로 사용하고 있습니다. electroporation은 주로 박테리아에 이용하고 있는데 박테리아의 경우 들어가 있던 플라스미드가 다시 나온다는 말은 들어보지 못한 것 같습니다. 보통 electroporation 방법이 Heat shock 방법보다 훨씬 효율이 높은데 콜로니가 뜨지 않는다면, 우선 selection하고자 하는 배지가 정상적으로 만들어 졌는지 확인하는게 좋을 듯 합니다. positive하게 자라는 yeast control이 있나요? trp나 leu 또는 Ura 가 빠진 배지를 사용하실텐데 vector의 selection marker와 맞지 않은 경우가 종종있습니다. 두번째로는 박테리아에서 주로 일어나는데 너무 높은 농도의 plasmid DNA를 사용하면 Burst가 일어나서 세포가 죽게 됩니다. Yeast는 제가 해본적이 없어서 뭐라 말씀 못드리는데 박테리아는 말그대로 터지는 소리가 납니다. 그럴경우에는 DNA 농도를 낮춰서 사용하면 문제가 해결 됩니다. 마지막으로 충분한 voltage를 주어야 DNA가 정상적으로 들어가는데 혹시 Yeast electroporation 하실 때 기계 세팅이 정상적으로 되었는지도 중요합니다. 가장 좋은 방법은 실험하실 때, 검증할 수 있는 positive control과 negative control을 동시에 사용하여 판변하는 것이 무엇보다 중요할 것 같습니다. 계속 문제가 발생하면 다른 방법 (Heatshock)으로 해보는 것도 좋을 듯 하네요. 아무튼 빠른 시일내에 문제가 잘 해결 되길 바랍니다.

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