실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
2A sequence로 polycistronic vector cloning, overlap PCP 관련하여 질문드립니다
레벨1 cye0125 (대학원생)
- 등록일 2023.05.22 19:52:57
- 조회1021
안녕하세요 2A sequence를 이용해 polycistronic vector cloning이 잘 되지않아 도움 여쭙고자 합니다.
만들고자하는 최종 산물은 다음과 같습니다
restriction enzyme1 - Target1 - P2A seq - Target2 - restriction enzyme2
R.E1-Target1-P2A seq 일부, p2A seq 일부-Target2-R.E2 로 첫번째 PCR을 하는건은 잘 되고 있으나,
오버랩 피씨알을 통해 final product를 만드는것이 잘 되지않습니다.
1. primer design 할 때 P2A full seq를 넣으려니 프라이머 길이도 너무 길어지고 Tm값 또한 너무 높은 문제가 있었습니다. 하여 2A seq 부분을 임의로 잘라 각 프라이머에 넣어두었습니다(각 프라이머간 2A 겹치는 부위는 약 20bp 정도입니다) 겹치는 부위 설정이 잘못되었을 가능성도 있을까요? 있다면 어떻게 프라이머 수정을 하면 좋을까요?
2. 앞서 1번에 말씀드린 것 처럼 Tm값이 너무 높아져서 시퀀스 일부를 나누어 프라이머를 만들 수 밖에 없었습니다. 무시하고 full sequence를 다 넣어 제작하여서 진행해도 될까요?
3. 오버랩 피씨알을 하였을 때 밴드가 여러 사이즈로 산발적으로 만들어지는 양상을 보이는것은 왜그런것인가요?
4. 60,65,68 등 anealling 온도를 다양하게 해서 테스트 하고 있습니다만 이외에 추가로 실험에 적용 할 만한 변동조건들이 있다면 조언 부탁드립니다.
5. 오버랩 피씨알 경험이 있으신 선생님들이 계시다면 실험 수행할때 주의해야할점이나 팁을 주시면 감사하겠습니다!
주위에 아무도 polycistronic vector cloning을 해 보신 분이 계시지 않아 이렇게 질문 드립니다, 약간의 조언도 큰 도움이 될 것 같습니다. 감사합니다!
#2A cloning
#overlap PCR
#polycistronic vector
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