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레벨5
실험조아
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2023.03.27 11:06
gel purification하면 yield가 주는 게 맞습니다.
그렇기 때문에 yield가 그 만큼 줄거라는 걸 가만해서 초기 digestion 양을 조절해야 합니다.
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레벨2
크리스12
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2023.03.27 11:08
음 ㅠㅠ 답답하시겠네요.
loss가 생각보다 많이 일어나는 원인은 경험상 다음과 같습니다.
1) enzyme cutting이 잘 되지 않음
enzyme에 의해 잘리지 않고 circular form으로 남아있는 벡터들이 있을 수 있어요. enzyme과의 반응시간을 넉넉하게 하면 수율이 좀 더 좋아질 수 있습니다. 다만 star activity가 더 생길 수는 있습니다ㅠ
2) elution할 때 세부적인 습관(?)
마지막에 elution단계에서,, elution buffer 또는 DW를 column 정중앙에 떨어뜨리고 약 30초에서 1분 정도 기다리는 과정이 있는데요, column에 elution buffer 또는 DW가 잘 스며들어서 column에 걸려있는 DNA가 더 잘 용해되어 잘 빠져나오게 하는 것 같습니다. 그리고 elution buffer나 DW를 너무 적게 사용해도 loss가 더 클 수 있습니다. elution 용량을 높이면 final concentration은 낮아지겠지만 수율 자체는 높일 수 있습니다.
enzyme cut product 자체를 gel run해서 한 번 보시겠어요?
잘리지 않고 circular form으로 남아있는 벡터가 많은지 먼저 확인해보세요.
>>>> 본문 내용을 제대로 안읽고 답글을 달았네요..
gel extraction의 경우 수율이 아주 많이 떨어지긴 하더라고요..
다른 분의 답글처럼 이를 감안해서 애초에 digestion을 많이 하는 게 가장 큰 해결방안 같습니다.
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레벨5
실험조아
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2023.03.27 11:18
gel extraction 시 loss는 당연히 발생하지만
크리스12님의 말씀을 참고하면
loss를 좀 더 줄일 수 있는 좋은 방법입니다!!
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레벨8
SPEED
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2023.03.27 11:48
- 수율이 최소 90% 이상이 안나오는 것 봐서는 gel extraction 방법에 문제가 있는 듯 합니다.
- 당연히 어떤 회수 실험도 100% 수율이 나오지 않지만 질문의 경우는 실험 방법을 다시 검토하는 것이 좋습니다.
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레벨5
실험조아
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2023.03.29 13:43
Qiagen kit 경우에도 80% 수율까지 보장하는데 90%이상 나오신다니 거의 신이신가 봅니다.
그 정도면 정상입니다.
필터컬럼형식의 키트는 경험상 수율이 50% 넘기도 힘듭니다.
클로닝 하기에는 충분한 양으로 보이네요.
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레벨8
SPEED
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2023.03.30 08:19
- 실험조아 , Qiagen kit 경우에도 80% 수율까지 보장하는데 90%이상 나오신다니 거의 신이신가 봅니다.
: 실험 내용은 실험내용으로 반박을 하고 한번 더 인신공격성 발언을 하면 bric 활동을 그만두는 한이 있더라도 그냥 넘어가지 않습니다.
- Bric 초창기 부터 활동해서 거이 30년이 다되어 가는데 사람에 대하여 이런 비꼬는 말투는 처음 듣습니다.
- 수율 보장은 최소 수율을 얘기하는 것이니까 실험 경험이 어느정도 인지는 모르겠지만 본인 실력으로 기준을 삼지 마세요.
실험내용을 보니 Single cut으로 Linearize 하는 것 같은데,
특정 fragment 만 분리해야하는 상황은 아니라면
Gel extraction 후 수율 문제가 지속되면
PCR clean up 과 같은 방법이랑,
PCI 처리 + 에탄올 침전 하는 방법도 한번 써보세요.
