DNA cutting후 purification잘 아시는 분.. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q DNA cutting후 purification잘 아시는 분..

레벨01 asdf1212 (대학원생)

23.03.27 10:46
조회3518

DNA cloning을 하기 위해서 enzyme cut이후 blunt end를 만들고 gel extraction kit의 filter tube에 넣고 washing 후 elution하였습니다. 그리고 nano-drop측정을 하였는데 loss가 너무 많이 일어나서 다시 진행하였습니다.

-enzyme cut 이후에도 gel extraction kit로 DNA만 얻었습니다.

-한 쪽만 blunt end를 만들기 위해 enzyme cut시 잘려나가는 부위는 없고 linear 형태가 됩니다.

이번에는 enzyme cut만 하고 이전과 같은 방법으로 DNA를 얻었는데 2ug을 사용했던 DNA의 양이 약500ng만 남게 되었습니다.

주변에 물어보니 이상이 없는 것 같은데 왜 그러냐는 소리를 듣다가 브릭에 올려봅니다.

cloning에 대하여 아는 것도 많이 없고 머리 싸메다가 올립니다. 고수님들 도와주시면 감사하겠습니다.

Mol. Biol.-DNA > Purification/Isolation

등록순
추천순

A 답변 8

레벨05 실험조아
23.03.27 11:06

gel purification하면 yield가 주는 게 맞습니다.

그렇기 때문에 yield가 그 만큼 줄거라는 걸 가만해서 초기 digestion 양을 조절해야 합니다.

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨02 크리스12
23.03.27 11:08

음 ㅠㅠ 답답하시겠네요.

loss가 생각보다 많이 일어나는 원인은 경험상 다음과 같습니다.

1) enzyme cutting이 잘 되지 않음

enzyme에 의해 잘리지 않고 circular form으로 남아있는 벡터들이 있을 수 있어요. enzyme과의 반응시간을 넉넉하게 하면 수율이 좀 더 좋아질 수 있습니다. 다만 star activity가 더 생길 수는 있습니다ㅠ

2) elution할 때 세부적인 습관(?)

마지막에 elution단계에서,, elution buffer 또는 DW를 column 정중앙에 떨어뜨리고 약 30초에서 1분 정도 기다리는 과정이 있는데요, column에 elution buffer 또는 DW가 잘 스며들어서 column에 걸려있는 DNA가 더 잘 용해되어 잘 빠져나오게 하는 것 같습니다. 그리고 elution buffer나 DW를 너무 적게 사용해도 loss가 더 클 수 있습니다. elution 용량을 높이면 final concentration은 낮아지겠지만 수율 자체는 높일 수 있습니다.

enzyme cut product 자체를 gel run해서 한 번 보시겠어요?

잘리지 않고 circular form으로 남아있는 벡터가 많은지 먼저 확인해보세요.

>>>> 본문 내용을 제대로 안읽고 답글을 달았네요..

gel extraction의 경우 수율이 아주 많이 떨어지긴 하더라고요..

다른 분의 답글처럼 이를 감안해서 애초에 digestion을 많이 하는 게 가장 큰 해결방안 같습니다.