plate에서 세포가 불균일하게 떨어집니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q plate에서 세포가 불균일하게 떨어집니다.

레벨01 먼머니 (대학생)

23.03.14 17:40
조회4094

현재 RBL-2H3 세포를 이용하여 Hexosaminidase 실험중입니다.

24-well plate에 적절한 농도로 seeding하여 20시간 배양한 뒤

sample 1시간 전처리 후 IgE를 처리하여 또 20시간 정도 배양하는데요

이 때 sample 처리 전에 세포가 떨어질까 wash 단계는 생략하였고,

샘플 처리 전 후 모두 세포가 잘 붙어 있었는데 전처리 1시간 뒤에 IgE를 처리하기 위해 세포를 꺼내서 현미경으로 보면 배지 교체만 해준 control군 중에 몇 well은 잘 붙어있는데 몇 개의 well은 또 떨어져 있더라구요. 오히려 샘플을 처리한 well에는 또 모두 세포가 잘 붙어있는 걸로 보아 샘플의 독성 때문은 아닌 것 같고, 단지 핸들링 문제인 것 같습니다.

여기서 제가 생각해 본 트러블슈팅은

1. Media suction : 1 ml 팁 끝에 10 ul 팁을 꽂아 석션, 석션 후에 세포 상태를 보았을 때 문제 없었음

2. 배지 교체 시 분주의 세기: 샘플은 벽면에 분주함, 분주 직후 incubation 하기 전에 현미경으로 보았을 때 잘 붙어있었음

이렇습니다.

1, 2번 모두 저의 생각은 이러한데 제가 잡지 못한 문제가 있을까요?

모든 well에서 세포가 떨어지면 plate 코팅 문제이지는 않을까 생각 해보겠는데, 세포가 너무 불균일하게 떨어져서요

plate는 corning (#3526) 사용중입니다.

조언 부탁드립니다.

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A 답변 3

레벨03 고로쇠물
23.03.14 18:44

Cell을 seed한다고 모든 cell이 생존하지는 않습니다. 그래서 seed이후 1일후 배양액을 교체하는건 seed 한 cell중에 부착 안된 cell을 치우고 붙은 애들만 키우는 목적입니다. 그러나 세포는 엄청 민감한 애들이라 아주 잠깐만 배양액을 교체한다고 석션하기 시작하면 말라서 죽는 cell이 생기기 시작합니다. 그래서 이과정은 속도가 생명입니다. 내용을 보면서 긴가민가 한데 혹시 Subculture를 수행했나요? 했다면 Flask를 어디서 어디로 옮겼나요? 사용한 시약은 뭐를 쓰셨나요? Trysin_EDTA? DPBS? 배지는 RAT니까 RPMI1640일건데, seed는 얼마정도로 seed하나요? Cell/ml값이 있나요? 그리고 flask당 배지는 얼마넣나요? 그리고 배지는 집적 만드시나요? 아니면 완제품인가요?(include FBS제품) 배지교체때 confluence 는 어느정도 되나요?

답변리플

레벨01 먼머니
23.03.14 22:42
질문자

답변 감사합니다.

24-well plate에 seed하기 전에 100 mm dish 에 계속 subculture 했습니다.(passage는 많지 않습니다)

subculture 시 배지 석션 후 DPBS로 워시하고 Tyrpsin-EDTA로 떼어냈고요. 배지는 ATCC에 나와있는대로 EMEM (Sigma) 사용 중입니다. FBS도 ATCC 참고하여 첨가해서 사용중입니다.

100 mm dish에 계대 이어하다가 24-well plate에 seed 할 때는 1x10^5 cells/0.4ml/well로 깔아줍니다. 하루동안 배양해 준 세포를 media suction 해준 뒤에 배지에 희석한 sample을 well마다 분주해주고 1시간 배양한 후 그 위에 소량의 IgE만 첨가해주었습니다. (24-well plate에 sample 분주 전 확인 했을 때 confluency는 약 50% 였습니다.)

다 잘 붙어있다가 배지 교체 후 좀 지나고 확인하니 조금씩 떨어져서 둥둥 떠다닙니다.

아니면 처음부터 세포를 고르게 분주하지 못해서 그럴까요? 모든 well은 아니지만 몇 개의 well은 세포가 조금 뭉쳐자란 게 있고 그 옆으로 듬성듬성 세포가 붙어있었거든요. 나중에 보니 그 뭉쳐자란 well에서 듬성듬성 자란 세포들이 다 떨어져있었습니다.

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨03 고로쇠물
23.03.15 13:19

일단 제 생각은 cell이 어떤한 환경이 바뀌어 죽어서 둥둥 떠다니는 것 같습니다. 아마 시약농도에 대한 문제와 시약 처리 과정의 문제라고 생각됩니다. 그중 저는 Tyrpsin이 독성이 강해서 세포가 죽어 둥둥 떠다니는게 원인이라고 생각합니다.

subculture 시 배지 석션 후 DPBS로 워시하고 Tyrpsin-EDTA로 떼어내셨다고 하셨는데 Tyrpsin-EDTA(농도 0.05%기준) 인가요? 보통 Tyrpsin-EDTA는 100mm dish면 0.75ml 분주합니다. 물론 세포주마다 제각각 오차는 있지만요. 그리고 저희 실험실은 Tyrpsin-EDTA처리후 co2 incubatordp 3min 반응후 꺼내서 1:9 비율 media를 첨가해 Tyrpsin 활성을 억제시킵니다. 물론 1:6비율이여도 되지만 생존율때문에 저희는 1:9비율을 합니다. 그래서 권장 EMEM을 6.75ml~5ml정도로 높여서 Tyrpsin 활성을 억제해보세요 ATCC는 세포컨디션이 좋은 상황에서 시험한경우도 있어서 완전히 정답은 아닙니다. 실험실 환경이나 기르는 플라스크에 따라서도 생존율이 변합니다. 제가 RBL-2H3세포주는 써보질 않아서 자세한 특성은 모르나 ATCC프로토콜과 저희 실험실방식이 좀 다릅니다. 피펫팅을 부드럽게 하라했지만 저희는 조직덩어리를 부수려고 피펫팅을 flask벽에 쎄게 7~10번 분사 합니다. 그리고 Tyrpsin도 2~3ml하라고 하는데 저희는 1ml만 합니다. 같은 75cm2너비 인데도요. 거기에 1:4로하라하는데 저희는 1:9입니다. 그래서 ATCC를 너무 맹신해서는 안되요.

글을 읽어보니 ATCC 프로토콜은 정답이고 자신의 기술과 실력이 부족해서 실패한다고 심하게 의식하고 있습니다. 자신을 믿으세요 그리고 세포는 원래 변수도 심한 애들이라 우리의 예상에 항상 맞게 움직이는 애들이 아닙니다. 그러니 조급해하기보다. 실험실의 환경에서 이 세포들이 어떻게 조정해주면 잘 적응하는지 조율해보세요.