Multiplex pcr에 관하여 | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q Multiplex pcr에 관하여

레벨03 해조칼슘풍덩 (대학원생)

23.02.02 16:16
조회2911

안녕하세요 현재 2개의 primer의 온도 조건을 동일한 온도로 각 각 확립하였고, 이후 이 두개의 primer를 같이 넣어 multiplex pcr을 진행한 결과 primer dimer 부분이 검출되어 이 부분을 보완하고자 아래와 같이 진행하였는데 나오질 않네요ㅠ 조언부탁드려요..ㅠㅠㅠ

 (첫 결과에서는 각 각의 primer의 bp 부분에 band가 검출되었으나 dimer 부분이 있어 수정해야했음)

변경사항 

1. 기존 pcr e tube total volumn을 25 ul 에서 50ul 늘려 기존과 같은 농도(20pmole)를 가진 primer의 첨가량만 줄여서 진행 1/2배, 1/4배( 0.5ul / 0.25ul)

-> 실험 결과 ; 밴드가 검출되지 않음. 

이후 추가 변경 사항

1.기존 pcr e tube volumn을 25 ul 에서 50ul 늘려 기존과 같은 농도(20pmole)를 가진 primer의 첨가량 변경
1배, 1/2배, 1/4배 (1ul, 0.5ul, 0.25ul)

2. cycle 수 30->35cycle로 증가

실험결과, 1배로 넣은 곳에서 희미한 band가 확인이 됨.  하지만 band가 너무 안보임...

Multiplex pcr primer의 경우 uniplex할 때와 다르게 1ul씩 넣던걸 0.5ul씩 반으로 줄여서 넣어줘야 한다고 들어서 진행을 하였으나.. 잘 안되네요 

도대체...multiple pcr을 어떻게 해야 정말 잘했다는 소리를 들을 수 있는지 선생님들의 스킬을 알려주시면 너무 감사드리겠습니다...


추가로 gel 제작시 저의 경우 EtBR을 첨가해주고 있는데(4ul/100ml) gel doc 촬영시 etbr이 너무 하얗게 빛이나 사진이 안예쁘네요ㅠ 추가 꿀팁이 있다면 알려주세요!

Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR

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A 답변 25

레벨08 SPEED heart
23.02.02 16:28

이런 문제는 전기영동 사진이 필요합니다.

각각 PCR 하면 어떻게 나오고 조건이 어떻게 되나요?

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.02 18:05
질문자

안녕하세요 스피드 선생님 

육안으로 밴드 확인 자체가 어려운 부분이 있어 사진으로 따로 남겨두질 않았습니다ㅠ 이 부분의 저의 실수네요ㅠ 실험결과의 경우 위에 작성과 같이 pcr이 아예 안돼서 band 자체가 아예 없던 결과와 
두번째의 경우 밝기를 엄청 높여야 희미한 band를 확인할 수 있었습니다. 

조건이라고하면 pcr product의 조건을 말씀하시는걸까요?

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레벨08 SPEED heart
23.02.02 19:19

두개를 단독으로 증폭했을 때의 PCR 조건과 결과는 어떻게 나왔나요?

EtBr을 gel에 넣는경우 현재 농도를 10배 희석해서 4ul사용해 보세요.

sample에 넣는경우가 가장 깨끗하게 나오는데 50배 희서해서 1ul/sample로 사용해 보세요.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.02 20:03
질문자

기존에 단독으로 증폭하였을 때 다른 프라이머의  사진은 없지만 첨부한 사진과 같이 다른 bp 에서 저런식으로 단일밴드가 뜨는 것을 확인하였습니다. PCR 조건의 경우 
94도 -3min(1cycle) / 94도 - 30sec, 68.2도 30sec, 72도-1min(30cycle) / 72도 - 7min(1cycle)으로 둘다 같은 조건으로 진행하고 있습니다.


추가로 현재 저희 실험실에서 쓰는 EtBr의 경우 액상이며 10,000ppm제품을 agarose gel 100ml에 4ul 분주하고 있는 상황입니다.

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레벨08 SPEED heart
23.02.02 22:36

다른 bp에서 band가 나오는 설명은 질문자만 알수있는 내용입니다.

target bp에 대한 설명이 어디에도 없습니다.

다시한번 질문을 하면 정확히 어떤점이 문제인가요?

1. 단독으로 증폭하면 각각 증폭이 잘되나요?

2. 증폭 band 크기가 각각 얼마인가요?

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.03 17:01
질문자

1675410966379.jpg (다운로드 : 244)

1.  단독으로 진행 할 시 위에 사진을 첨부한 것 처럼 밴드가 잘 나옵니다. 

2. 증폭하여 나오는 target band의 경우 118bp 및197bp에서 검출이 됩니다. 

(금일 실험한 Multiplex pcr 진행하여 나온 결과 첨부합니다!.)

사진에 대한 설명) 
1번 100bp DNA ladder 
2~7번의 경우 197bp에서만 검출이 되어야하며, 
8~13번의 경우 197, 118bp 에서 band가 나와야하는 것이 목표였습니다. 그러나 첨부한 사진과 같이 100bp밑에서 예상치 못한 band들이 검출됩니다...

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.03 17:04
질문자

스피드 선생님 궁금한 점이 또 있습니다. EtBr의 경우 50배 희석하여 sample과 섞어 로딩하라고 하셨는데 이 때 loading dye 또한 첨가해주는것이 맞는지요?

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레벨08 SPEED heart
23.02.03 19:43

197, 118을 단독으로 증폭한 결과는 없나요?

template가 어떤 종류인가요?

annealing 68.5도인데 primer 길이가 어떻게되나요?

전기영동시 dna + s.buffer + etbr로 하면 됩니다.

50배 희석은 첨부사진을 보고 추정한 것이므로 결과를 보고 희석배수 조정이 조금 필요할 수 있습니다.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.04 00:04
질문자

CYMERA_20230204_000427.jpg (다운로드 : 208)

단독으로 증폭한 전기영동 사진 첨부합니다.
Annealing 온도의 경우 68.2도이며,  primer의 길이는 197bp - 19mer / 118bp - 21mer입니다..

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레벨08 SPEED heart
23.02.04 07:54

197은 320 부근에 band가 있는거 아닌가요?

118f/197f, 118f/197r, 118r/197f, 118r/197r로 증폭을 해보세요.

Tm은 다시 계산을 해보세요.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.05 19:29
질문자

안녕하세요 선생님 

사진 속 ladder의 경우 100bp ladder 입니다. 
아래서부터 100 200 으로 증가하는 것이며, 전기영동시 앞 부분이 휘어서 내려왔기에 197bp에 제대로 나타난 것이 맞습니다. 또한 Tm 값의 경우 primer가 RAPD primer를 따와 제작한 것이기에,
회사에서 알려준 tm 값보다 낮은 온도 부터 고온으로 gradient를 진행하였고 단일밴드만을 얻기위해 여러번 PCR한 결과 68.2도라는 tm값을 얻게된 것입니다.  스피드 선생님께서 말씀하신대로 금일 118f/197f, 118f/197r, 118r/197f, 118r/197r 로도 증폭 해보겠습니다.  감사합니다😄

Insilico 상에서 self dimer의 경우는 희박하나,  cross dimer 의 경우 어느정도 있는 것으로 확인한 상태입니다.

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레벨08 SPEED heart
23.02.05 22:46

휘어지것 말고 위에 band가 보입니다.

primer 교차는 dimer와 상관이 없습니다.

사진은 모니터를 바로 찍으면 정확한 판단이 조금 어렵습니다.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.05 23:35
질문자

아무래도 카메라로 찍은 것을 첨부하다 보니 band로 보인 것 같습니다. 실제로는 band가 없습니다...

혹시 그러면 primer 교차하여 진행하라고 하신 것이 어떠한 이유인지 알려주실 수 있을까요. 제 주변에 이쪽 분야로 하는 사람들이 없어 조언을 구하기 어렵다 보니 부족한 점이 많습니다..

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레벨08 SPEED heart
23.02.06 08:18

- primer 교차 증폭은 결과를 보고 설명을 드리겠습니다.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.06 15:21
질문자

Primer 교차.JPG (다운로드 : 232)

안녕하세요 선생님 선생님께서 말씀하셨던대로 증폭한 결과 입니다. 119F/197R , 119R/197R에서만 밴드가 발견되었습니다. <img alt="upload_image" height="303" src="/upload/geditor/202302/0.91432400_1675664407.jpg" width="562" />

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레벨08 SPEED heart
23.02.06 15:31

- 전기영동 결과에 마커가 없나요?

 

- 마커가 없으면 분석이 힘듭니다.

 

- 몇% gel인가요?

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.06 16:32
질문자

1675668628274.jpg (다운로드 : 187)

사진 다시 첨부드리며, 2% gel을 사용하였습니다.

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레벨08 SPEED heart
23.02.06 17:25

같은 시료 2개 씩인데 어떤 뜻인가요?

PCR 성분의 각 농도가 어떻게되나요?

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.06 18:38
질문자

제가 가진 샘플이 식물체 이기에 서로 다른 샘플을 이용하여 증폭한 것입니다!

pcr 성분의 각 농도라고 말씀하시는게, 말 그대로의 pcr product의 농도인것인지, 또는 성분 조성을 말씀하시는 것인지 알려주실 수 있나요,,,? 

제가 알려드릴 수 있는 것은 product의 조성의 경우 10X Reaction Buffer 2.5ul, 10 mM Stabilized dNTP 0.5ul, primer (20 &mu;M) 각 0.5ul, template 70ng/ul , Taq polymerase 0.5ul 분주 후 H2O로 25ul 로 make up한 것이며,

pcr product 농도 측정 결과 loading dye와 product가 섞인 상태여서 블랭크를 잡아도 높은 값으로 측정되는데 이게 맞는지 잘 모르겠습니다...대략 400ng/ul 이상이 나오는데 이게 맞는건가요?ㅠㅠ,,,,,,

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레벨08 SPEED heart
23.02.06 19:00

PCR product 농도 측정은 힘듭니다.

primer 농도가 너무 낮기 때문에 현재 농도에서 2ul를 사용해 보세요.

전기영동은 현재의 2/3만 내리세요.

마커는 1/2만 loading하세요.

젤 사진은 젤이 모두 들어가게 촬영하세요.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.06 19:42
질문자

그러면 선생님 께서 알려주신 조건으로 197f, 118f/197r, 118r/197f, 118r/197r 것과 기존에 했던 pcr을 다시 해보면 될까요?

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레벨08 SPEED heart
23.02.06 19:47

우선 오늘 첨부한 결과만 primer를 늘여서 해보세요.

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.07 00:23
질문자

1675696899864.jpg (다운로드 : 203)

선생님 말씀하셨던 내용들 반영하여 증폭한 결과 입니다.!!

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레벨03 해조칼슘풍덩
23.02.07 00:23
질문자

1675696899995.jpg (다운로드 : 176)

조금 더 어둡게 찍은 사진도 첨부해둡니다.

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레벨08 SPEED heart
23.02.07 08:17

- 전기영동 결과가 훨씬 나아졌습니다.

 

- 그래도 PCR에 뭔가 이상한 점이 있습니다

 

1. PCR mixture를 만든 후 증폭하지 말고 바로 전기영동 해보세요.

 

2. 제일 처음 첨부한 전기영동 시료를 현재 조건으로 다시 증폭해서 전기영동 해보세요.

 

3. 제일 처음 첨부한 전기영동 사진의 2~7, 8~13의 차이는 어떤건가요?