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커뮤니티  >  실험 Q&A

Q cell subculture 방식에 대한 질문

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레벨03 쥐팤 (대학원생)

  • 22.12.01 15:07
  • 조회4513

안녕하세요 

새내기 대학원생입니다.

 

cell subculture시 trypsin 처리 하고 media로 트립신을 희석시켜서 하는 방법과

trypsin 처리 하고 centrifuge 돌려서 trypsin 제거 하고 media로 resuspension 해주는 경우 중 어떤 것을더 선호하시나요?

선호하시는 것이 있으시다면 그 방법을 선호하는 이유와 만약 첫 번째 방법을 사용하신다면 트립신이 몇 퍼센트까지 괜찮은지 알려주신다면 감사하겠습니다.(예를들면 media 20ml에 트립신 2ml 정도 -> 10%등)

 

감사합니다.

Cell Biology > Cell Culture

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A 답변 5

  • 레벨05 실험은안될때가더많아
  • 22.12.01 15:46

trypsin은 FBS포함되어 있는 media로 inactivation 후 제거해주는 편이 낫습니다.

보통 처리한 trypsin: media 1:3~ 1:4비율로 inactivation후 centrifuge -> supernatant aspiration -> resuspension 의 과정을 거치는 것을 추천합니다.

더 완벽히 제거하려면 resuspension을 PBS나 media에 한 뒤 다시한번 centrifuge ->supernatant aspiration -> resuspension -> seeding을 가시면 좋구요.

남아있는 trypsin이 이후 실험에 어떠한 영향을 끼칠지 알지 못하기 때문에 최대한 inactivation, 제거가 필요합니다.

  • 레벨08 안재진
  • 22.12.01 15:46

부착 세포배양의 기본 메뉴얼은

DPBS washing

0.25% Trypsin 5ml / 100cm^2 37도 incubation

Complete media washing 및 원심분리 입니다.

최적의 세포배양법은 일부 랩마다 틀릴수는 있지만 기본은 비슷할것입니다.

Tyrpsin 만 가지고 원심까지 가면 시간이 너무 길어질수 있어서 추천드리지 않습니다.

  • 레벨01 9999 (비회원)
  • 22.12.01 16:22

윗 분들 말씀처럼

Trypsinization 후에 Media를 넣는 이유는

Media에 넣어준 Serum이 Trypsin을 불활성화시키기 때문입니다.

이 때 미디어 볼륨은 트립신과 동량 이상이면 됩니다.

다만 요새 Serum free complete media도 나오는 실정이라 이런 경우에는 FBS를 따로 넣어주어야하지 않을까 조심스레 추측해봅니다.

  • 레벨08 SPEED heart
  • 22.12.01 17:03

- 희석하는 방법은 사용하지 않는 것이 좋습니다

 

- cell을 detach한 후는 2가지 방법이 있는데

1. FBS로 trypsin inactivation 후 원심분리 및 culture

2. 1차 원심분리 후 최대한 media + trypsin 제고 후 PBS로 최소 3회 이상 washing 및 culture

 

- 위 1, 2 모두 무방 합니다. 

  • 레벨03 쥐팤
  • 22.12.01 19:49
  • 질문자

그렇군요 .. 방법을 바꿔야겠습니다.

답변해주신분들 모두 감사드립니다.

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