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cell subculture 방식에 대한 질문

레벨3 쥐팤 (대학원생)

안녕하세요

새내기 대학원생입니다.

cell subculture시 trypsin 처리 하고 media로 트립신을 희석시켜서 하는 방법과

trypsin 처리 하고 centrifuge 돌려서 trypsin 제거 하고 media로 resuspension 해주는 경우 중 어떤 것을더 선호하시나요?

선호하시는 것이 있으시다면 그 방법을 선호하는 이유와 만약 첫 번째 방법을 사용하신다면 트립신이 몇 퍼센트까지 괜찮은지 알려주신다면 감사하겠습니다.(예를들면 media 20ml에 트립신 2ml 정도 -> 10%등)

감사합니다.

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답변 5

trypsin은 FBS포함되어 있는 media로 inactivation 후 제거해주는 편이 낫습니다.

보통 처리한 trypsin: media 1:3~ 1:4비율로 inactivation후 centrifuge -> supernatant aspiration -> resuspension 의 과정을 거치는 것을 추천합니다.

더 완벽히 제거하려면 resuspension을 PBS나 media에 한 뒤 다시한번 centrifuge ->supernatant aspiration -> resuspension -> seeding을 가시면 좋구요.

남아있는 trypsin이 이후 실험에 어떠한 영향을 끼칠지 알지 못하기 때문에 최대한 inactivation, 제거가 필요합니다.

부착 세포배양의 기본 메뉴얼은

DPBS washing

0.25% Trypsin 5ml / 100cm^2 37도 incubation

Complete media washing 및 원심분리 입니다.

최적의 세포배양법은 일부 랩마다 틀릴수는 있지만 기본은 비슷할것입니다.

Tyrpsin 만 가지고 원심까지 가면 시간이 너무 길어질수 있어서 추천드리지 않습니다.

윗 분들 말씀처럼

Trypsinization 후에 Media를 넣는 이유는

Media에 넣어준 Serum이 Trypsin을 불활성화시키기 때문입니다.

이 때 미디어 볼륨은 트립신과 동량 이상이면 됩니다.

다만 요새 Serum free complete media도 나오는 실정이라 이런 경우에는 FBS를 따로 넣어주어야하지 않을까 조심스레 추측해봅니다.

- 희석하는 방법은 사용하지 않는 것이 좋습니다

- cell을 detach한 후는 2가지 방법이 있는데

1. FBS로 trypsin inactivation 후 원심분리 및 culture

2. 1차 원심분리 후 최대한 media + trypsin 제고 후 PBS로 최소 3회 이상 washing 및 culture

- 위 1, 2 모두 무방 합니다.

그렇군요 .. 방법을 바꿔야겠습니다.

답변해주신분들 모두 감사드립니다.