PCR시 100bp이하의 band 검출 관련입니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q PCR시 100bp이하의 band 검출 관련입니다.

레벨01 Cheddar (대학생)

22.11.30 22:01
조회2375

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PCR을 했는데 원래 detect 되어야하는 size에서는 band가 안나오고 2번째 line과 같이 100bp 이하에서 band가 나왔습니다...

다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다.

이유 알고계신 분 있으시면 꼭 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ 감사합니다.

Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR

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A 답변 5

레벨08 SPEED heart
22.11.30 22:39

template가 어떤 종류이고 primer는 어떻게 디자인했나요?

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레벨01 Cheddar
22.12.01 10:39
질문자

어류에서 total RNA를 분리해 cDNA 합성한 것을 template로 사용했고, primer은 기존에 실험실에서 있던걸 사용했습니다.

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레벨08 SPEED heart
22.12.01 10:49

사용한 primer로 예전에 증폭이 잘 되었나요?

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레벨08 강시
22.12.01 11:06

다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다.

=> cloning이 되었는지 확인이 되지 않은 상태에서 sequencing을 보낸것이 아닌가 싶군요.

가능하다면 gradient PCR롤 해 보시지요.

아니면 primer를 다시 디자인하거나 cDNA가 제대로 만들어졌는지도 확인해볼 필요가 있어보입니다. 가령 house keeping gene이 잘 PCR 증폭되는지 확인하는 정도.....

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레벨02 Steady
22.12.05 10:44

T-vector로 Clonging 하신거면, Cloning 됐는지 확인하기 위해 enzyme cutting으로 확인해보시는게 좋을 것같네요. ( 물론, 사용하신 primer에 enzyme site가 있을때 )

Sequencing을 보냈는데 T-vector로 나온거면 Cloning이 되지 않은 것같습니다. 그리고 보통 TA-cloning을 하고 Sequencing을 보낼 때 개인적으로 design한 priemr를 보낼 필요 없는걸로 알고있어요. 마크로젠의 경우 TA-cloning한 DNA sequence 확인용 primer(SP6&T7)를 가지고 있는 것으로 알고있습니다.