어떤 염기서열을 사용하였는지 어떤 키트를 사용하였는지
어떤 PCR시간 온도조건인지 적어 놓지 않으면 원인을 찾기 힘들 듯 합니다.
50이면 매우 낮긴 하네요. 요즘 나노드랍은 Ds,Ss,DNA,RNA모두 선택가능하니
측정 항목은 잘 선택 된 건지, 또 모든 샘플이 이동시 아이스상에서 존재하였는지,
RNase는 충분히 억제하였는지 돌아볼 필요가 있습니다.
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2022.08.09 14:36
- 현재 진행하는 추출 방법을 알면 문제점 확인이 쉬울 것 같습니다.
RNA prep시 세포의 갯수가 너무 적은건 아닌지요?
펠렛이 확연하게 보이는건 염+불순물(단백질들)때문입니다.
순수한 RNA는 펠렛이 눈에 잘 보이지 않습니다.
5x 10^5 cell정도를 500 ul Trizol로 prep후 30ul정도로 elution하면
ES cell 기준으로 200ng~500ng/ul 정도 나옵니다.
저희는 RNA추출 실험전에는 DEPC와 에탄올로 두번이상 기구와 실험대 등을 닦아 사용합니다.
그리고 샘플은 최대한 저온을 유지해주고요.
제가 보기에는 추출 실험과정상에서는 별 문제가 없어보입니다.
일반적인 protocol을 진행중이시군요..
다만 elution을 너무 많이 하네요... 500ul로 elution하지 않고 50ul로 elution해도 될텐데... 물론 lab protocol이 그렇게 되어있다면 뭐 어쩔 수 없지요...
(아마도 elution에서 희석이 너무 강하게 되어 농도가 적게 나오는듯 하군요)
그게 아니라면,
10번 스텝에서 실험실 환경에 따라 pellet이 강하게 말라버리면 elution이 충분히 되지 않습니다.
elution buffer 혹은 DEPC treated water (ultra pure water) 온도를 45도정도로 따끈하게 heating 시키거나 혹은 elution을 heat block (60도정도)에서 수행하는 protocol도 존재합니다.
10번 스텝시 drying대신 spindown 후 새로운 멸균 팁으로 잔여 70% washing EtOH를 제거한 후 1분정도 말리고 elution step으로 들어가는 방법도 많이 사용합니다.
세포에 따라 다르지만, 6-well에 가득찰 정도의 세포라면 쓰고도 남을 RNA를 얻을 수 있습니다. (ES cell의 경우 오히려 6 well의 경우 gDNA가 충분히 제거되지 않아 문제가 되기도 합니다, 그래서 12 well이나 24 well을 이용하여 실험을 하기도 하죠...)
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레벨8
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2022.08.09 17:23
- TRIZOL을 넣은 후 강하게 볼텍싱을 해 주는 것이 좋고 현재 방법도 큰
문제없습니다.
- 농도가 낮은것은 마지막에 너무 많은 양으로 녹여서 그렇기 때문에 녹이는
양을 줄이면 농도가 올라갈 겁니다.
- 현재 진행 상태는 극히 정상적입니다.
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공공펄
(비회원)
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2022.08.09 17:29
감사합니다! ㅠㅠ
아 또 ... 260/280 값이 항상 1.80 언저리 (가끔은 1.7후반도 나옵니다) 나오거나 이런식으로 Nucleic acid conc는 적고, 260/280값은 1.7 초중반이 나오는 경우가 있는데,
마지막에 사용되는 udw양을 줄여 nucleic acid conc가 높아지면 260/280값이 더 안정적이게 나오게되는지도 여쭤봐도 될까요?
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2022.08.09 17:57
- A260, A280 모두 올라가겠지만 A260이 더 올라갈겁니다.
- 추출 방법이 손에 익으면 순도가 안정적으로 나올겁니다.
- 또한 RNA는 분해 되지 않고 intact하게 추출하는 것이 가장 중요한데 이것은
전기영동으로 확인할 수 밖에 없습니다.
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Coolzinc
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2022.08.09 18:51
1. Dry 시간이 너무 오래되어 마지막에 넣어주는 DW 에 RNA가 충분히 녹지 않음.
2. Elution volume 을 너무 많이 사용하여 상대적으로 농도가 낮게 나타남.
그런데 지금 올리신 RNA 농도에서 충분히 cDNA 합성이 가능한데
total RNA 1ug 기준을 맞추시려고 농도가 낮다고 말씀하시는건가요?
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2022.08.10 12:46
- 핵산은 dry할 수록 DW에 잘녹습니다.
- 잘 안녹는 경우는 불순물이 많은 경우.
