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세포에 형광염색할때

레벨2 와디와디 (대학생)

등록일 2022.08.03 11:36:16
조회2333

안녕하세요. 세포실험은 초짜인 대학원생입니다.

저는 mammalian cell에 bacteria를 처리한 후 약물처리를 해서, bacteria가 줄어드는 양상을 현미경으로 관찰하는 실험을 하고 싶습니다만... 저희 연구실에서 아무도 해본 적이 없고 저도 처음이라서 막막하여 글을 남깁니다.


1. 항체는 꼭 2차까지 처리를 해야하나요? 만약 Mammalian cell의 세포질을 타겟하는 형광이 붙은 antibody와 bacteira를 타겟하고 형광이 붙은 antibody가 존재한다면 그 두 개를 동시에 처리하고 바로 형광 현미경을 보아도 될까요?? 

2. 찾아보니 Mounting용액에 DAPI가 섞인 제품도 있던데 ... mounting?? 봉입체?? 를 꼭 해주어야하는건가요? 그리고 mounting 용액에 DAPI가 들어간 것은 DAPI가 핵을 염색시키면 그 후에 추가 wash과정 없이 현미경을 보는 건가요? 

ㅠㅠ 초보라 질문이 많고 기본적인것일수도 있지만 아시는 분은 상세한 답변 부탁드리겠습니다.

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답변 2

답변등록

-_- (비회원)
2022.08.03 14:49

채택답변
질문자가 채택한 답변입니다.

1번 질문에서 만약~ 뒤에 예시를 든 건 1, 2차가 한번에 붙어있는 식이고 이런 거 좀 비싸지 않나요?

보통 프라이머리 안티바디는 샘플의 단백질이나 다른 분자에 붙는 거고,

세컨더리 안티바디는 프라이머리 안티바디가 유래한 동물종의 특이성에 따라 붙는데

형광이 달려서 우리가 광학적으로 표지를 탐지할 수 있는 거고.

질문만 봐선 뭔가 프라이머리 세컨더리 안티바디의 개념을 잘못 생각하시는 거 같습니다.

질문에서 예시를 드신 건 더블 스테이닝인데 이건 그냥 해도 대개 별 문제없이 됩니다.

(안 되는 경우들이 가끔 있긴 한데 그건 그 때 트러블슈팅을 해야)

단 프라이머리 안티바디가 유래한 동물종이 달라야 됩니다.

안 그럼 세컨더리 안티바디가 똑같이 표지해버리니깐요.

2번 질문은... 세포는 안 다뤄봐서 모르지만 마운팅 솔루션은 샘플 만들 때 쓰고...

적절한 마운팅 솔루션을 써야 염색해둔 샘플의 형광이나 상태가 잘 보존됩니다.

안 쓰실 거면 그냥 키운 플레이트 그 상태로 관찰하거나 하는 방법도 있겠네요.

마운팅 솔루션에 다피가 든 건 뭐 워싱할 필요도 없이 그냥 바로 보시면 됩니다.

애당초 그래라고 나온 제품이니깐요. 아니면 다피 없는 것도 파니 그걸로 구하세요.

beulah (비회원)
2022.08.04 14:42

짧은 지식으로 답변을 달아보자면...

 

1. Mammalian cell을 target하면서 형광이 붙은 Ab, bacteria를 target하면서 형광이 붙은 Ab 모두 찾아보시면 있을 겁니다. 하지만 대부분 1차 Ab를 구매하고 2차 Ab를 따로 쓰고 있습니다. (예를 들어, anti-X Ab with Alexa flour 488 이렇게 형광이 붙은 Ab도 물론 있습니다만, 특정 색으로만 관찰할 수 있다는 점과 다루다보면 형광이 bleach될 수도 있는 등의 단점이 있을 것으로 사료됩니다)

만약 찾으셨을 때 두 Ab를 모두 구매할 수 있고 랩에 시약비가 충분하다면 굳이 불가능하지는 않을 것 같습니다.

2. 며칠이라는 시간 동안 보관하면서 형광현미경, confocal 등을 사용하여 사진을 찍을 계획이 아니라 그냥 한 번만 촬영하고 버리실 거라면, 굳이 mounting은 안해도 됩니다만 형광 사진의 퀄리티에 영향을 주었었습니다. (PBS 로 마지막 step에서 wash할 시 금방 말라버린다거나 이로 인해 cover glass가 얼룩덜룩해지는 등..)

저의 경우 DAPI가 포함되어 있는 mounting solution을 사용할 경우 추가 wash 하지 않아도 핵은 잘 보였습니다.

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