DCFDA ROS assay 도움 요청합니다!! | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q DCFDA ROS assay 도움 요청합니다!!

레벨05 귤여섯개 (과기인)

22.05.03 19:21
조회4441

안녕하세요?

최근 DCFDA 시약을 이용하여 H2O2와 약물을 처리하고 ROS를 보는 실험을 진행중입니다. 그런에 H2O2를 1mM, 1.5mM 로 4시간을 처리했음에도 불구하고 control과 차이가 없거나 오히려 낮은 형광 값이 나타납니다.

측정은 Tecan plate reader를 형광 파장에 맞추서 사용합니다. bottom reading이 안되는 제품이라서 top reading에서 Z값 스캔 후 진행하기도 해봤고 cell lysis 시켜 solution 상태에서 top reading으로 측정도 해보았습니다. plate는 당연히 falcon 96 well black clear bottom plate를 사용했구요. lysis 전이나 후나 결과의 양상이 비슷합니다.

간혹 plate reader를 사용하면 잘 되지 않아 Facs를 추천하는 글을 많이 보게 되는데 저희는 어떻게든 plate reader로 측정해내야 하는 상황입니다.

경험이 있으신 연구자 분의 조언을 구합니다.

댓글도 감사하고 nanniceguy@hotmail.com으로 연락처 남겨주시면 더욱 감사하겠습니다.

Cell Biology > etc.

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A 답변 3

레벨01 텐단 (비회원)
22.05.03 20:56

혹시 플레이트는 어떤것을 사용하시나요?

제 경우 형광이라 다막힌 블랙 플레이트를 사용했었습니다

그리고 워싱을 너무 많이하거나 세게 하면 형광이 약하게 나오기도 합니다

답변리플

레벨01 Q.E.D.
22.05.03 21:47

ROS assay 관련은 plate도 중요하지만
형광 스탠다드도 금방 발광이 적어지기에
저 같은 경우 샘플이 30분 반응이었는데,
25분 쯤 지났을 때 스탠다드를 만들기 시작해서
30분 끝나자 마자 바로 well에 넣고 찍으러 갔어요 ^^

만들때는 벤치 내 형광등도 끄고 했구요
그리고 96well plate 가장자리들은 사용 안 해요.

그리고 만약 cell 과 sup을 따로 한다면
두 개 패턴이 다르게 나올 수 있는게 맞구요
lysate로 만든다면,
시간이 없어서 분해를 제대로 못 할 수 있는데,
그 경우 값이 더 튀기 때문에
시간 내에 제대로 분해 해서 넣으세요!

아, 그리고 혹시 H2O2가 너무 과할시에 세포 자체가
죽어서 떨어져 나가기 때문에 결과가 이상 할 수
있으니까 같은 조건에서 MTT assay도 같이 해보세요

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨05 귤여섯개
22.12.08 19:11
질문자

혹시 저와 같은 문제를 마주치는 분이 있을까봐 해결방법을 댓글로 남깁니다~

질문의 실험 protocol은 H2O2와 약물 모두 처리 해 놓고 마지막에 DCFDA 를 넣었습니다.

여러 방법으로 시도해보면서 문제가 해결된 protocol을 말씀드리자면,

세포에 DCFDA를 먼저 넣어놓고 약물과 H2O2를 넣어 incubation 시킨 다음 형광을 찍으면 해결이 되었습니다.

DCFDA를 먼저 넣어놓고 실험을 하는 것이 핵심이었던것 같습니다.

DCFDA 시약 제조사의 protocol에 따라 먼저 넣는 것도 있고 맨 마지막 스텝에 넣는것도 있는데 plate reader로 읽어내야 하는 저의 경우에는 전자에서 농도에 비례하게 아주 잘 나오는 것으로 확인되었습니다. live 상태에서 bottom reading이 아닌 top reading으로도 결과가 잘 얻어졌습니다.