DMSO에 녹인 약물의 PBS 희석액에서 PBS만 제거하는 방법이 있나요? | 답변 > 실험 Q&A > 커뮤니티

Q DMSO에 녹인 약물의 PBS 희석액에서 PBS만 제거하는 방법이 있나요?

레벨05 Arkadis (과기인)

21.04.05 11:32
조회2667

dialysis로 liposome에서 방출된 약물을 sampling 했습니다. 그런데 방출된 약물이 PBS 내부에서 균일하게 존재하지를 못하더군요. 애초에 solubility가 water insoluble한 약물이라...

sampling까진 vortex로 계속 섞어주기에 문제는 없습니다만, release test 함량측정을 위해 HPLC 대기하는 시간동안 응집이 일어나서 값이 많이 튑니다.

그래서 PBS만 제거하고 DMSO에 다시 희석해서 측정을 하고 싶은데 어떻게 방법이 없을까요? 저희가 워낙 작은 사업단이라 evaporator같은 장비도 없어서 더욱 고민중입니다.

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A 답변 9

레벨08 SPEED heart
21.04.05 11:48

앞전 질문에 답변했듯이 분석 농도 한계 안에서 DMSO로 희석해서 분석하면

됩니다.

실험 전에 sample 분석 protocol을 먼저 확정해야 합니다.

실험 중에 분석 방법을 찾는 듯이 보입니다.

DMSO 농도 별 약물의 용해도는 어느정도 인가요?

답변리플

레벨05 Arkadis
21.04.05 12:12
질문자

저희가 사용하는 약물이 100% DMSO 기준으로

UK-5099 : 70mM (>20mg/mL)

RCGD423 : >100mM (34.2mg/mL)

rapamycin : 109.39mM (100mg/mL)

oligomycin : >380mM (300mg/mL)

입니다.

현재 용해도에서 난항을 겪고 있는 것이 RCGD423과 rapamycin 두 종류인데 가장 심각한 RCGD423의 경우 100% DMSO에 10mM까지 희석한 다음 PBS에 희석해서 사용하고 있습니다.

S/N ratio는 standard curve에서 최소값이 10이상 나오는데 RCGD 423의 경우 가끔 이론최대값보다 10배이상 뛰어서 검출되고 있습니다.

HPLC 학술지원을 받아보니 원인이 균일하게 분포되지 않아 밀집된 곳을 injection해서 그런 것 같다고 하더군요..

답변리플

레벨08 SPEED heart
21.04.05 12:18

- HPLC 학술지원을 받아보니 원인이 균일하게 분포되지 않아 밀집된 곳을

injection해서 그런 것 같다고 하더군요..

: 방법이 잘못된것 같습니다.

처음부터 sampling 후 100% 용해 및 분석해야 합니다.

이 방법으로 잘 나왔다 하더라도 신뢰성이 낮은 결과값입니다.

DMSO 농도별 분석 결과는 없나요?

free drug분석방법 외에 drug releasing test의 drug 분석 방법을 정립한 후 실험해야

할것 같습니다.

답변리플

레벨05 Arkadis
21.04.05 12:23
질문자

pure DMSO나 PBS에 농도별 희석해서 측정한 결과는 따로 가지고 있는 것이 없습니다.

pure DMSO의 경우엔 업체에서 기본으로 제공하는 HPLC ds정도만 있습니다.

drug release test의 경우 실험설계자가 없어서 reference를 검색해서 그 중 가장 많이 사용되고 저희가 바로 실행할 수 있는 dialysis method를 사용했는데 그외에도 방법이 따로 있나요?

답변리플

레벨08 SPEED heart
21.04.05 14:02

- pure DMSO나 PBS에 농도별 희석해서 측정한 결과는 따로 가지고 있는 것이

없습니다.

: protocol이 필요합니다.

또한 drug release test 방법은 앞전 답변에 있을겁니다.

답변리플

레벨05 Arkadis
21.04.05 15:12
질문자

이전 답변에서 말씀하신 UF같은 경우에 liposome을 거르는 방법이 아닌가요?

UF로 분자량 1000미만의 분자단위 filtering은 어렵지 않나요?

현재 문제가 되고 있는 부분인 drug의 용해관련 문제가 UF로 해결이 가능한지 잘 모르겠습니다.

예산 및 재고상의 문제로 1mL정도의 소량으로 liposome을 제조하여 방출된 free drug을 측정하여 방출량을 결정하는 실험을 진행하는지라 대량으로 실험할 수가 없습니다..

+)현재 100% DMSO부터 먼저 standard curve에 대한 validation을 진행하고 있습니다.

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨08 SPEED heart
21.04.05 16:06

- 이전 답변에서 말씀하신 UF같은 경우에 liposome을 거르는 방법이 아닌가요?

: 당연히 분석시 혼입된 liposome을 100% 제거해야 합니다.

- UF로 분자량 1000미만의 분자단위 filtering은 어렵지 않나요?

: UF MWCO1000을 추천한 적은 없습니다.

- 현재 문제가 되고 있는 부분인 drug의 용해관련 문제가 UF로 해결이 가능한지

잘 모르겠습니다.

: 어떤 방법을 사용하든 용해 문제는 별개의 문제로 해결해야 합니다.

- 예산 및 재고상의 문제로 1mL정도의 소량으로 liposome을 제조하여

: 1ml 제조하면 몇 시간 동안 몇번, 1회 몇 ul씩 sampling하나요?

- 몇 방출된 free drug을 측정하여 방출량을 결정하는 실험을 진행하는지라

대량으로 실험할 수가 없습니다..

: 대량실험이 필요한 것이 아니라 재현성있고 정확한 결과를 얻을수 있으면

됩니다.

- 현재 100% DMSO부터 먼저 standard curve에 대한 validation을 진행하고

있습니다.

: DMSO에 잘 녹는다고 한것 같은데 100% DMSO에서의 STD curve가 있는거

아닌가요?

의약품 개발은 일반 연구용 실험과 달리 QC나 제조공정에서의 validation이

우선되어야 합니다.

validation되지 않은 분석 방법은 결과 신뢰성을 인정하지 않고 있습니다.

실험 protocol을 확정한 후 분석 protocol을 validation하는 순서로 진행해야

합니다.

답변리플

레벨05 Arkadis
21.04.06 17:08
질문자

HPLC method 같은경우에는 STD를 이용한 validation은 끝났습니다.

근데 정작 sampling한 sample의 측정 peak area가 자꾸 흔들렸었던거죠.

현재 사용중인 sampling 방법은 reverse dialysis로, 초기 1mL에서 3회 washing한 liposome이 포함된 PBS 희석액 1.1mL에 0.3mL PBS가 loading된 dialysis device를 꽂아 device에서 100uL을 sampling하고 다시 PBS 100uL을 채워넣는 방식으로 0, 1, 2, 3, 6, 12, 24시간에 sampling을 하고 있습니다.

STD는 짧은 시간안에 찍어서인지 validation때나 실험때는 문제가 없는데, sample은 sampling 후 최대 24시간까지 autosampler 안에서 injection 대기 상태로 있는지라 문제가 발생하는 것 같더군요.

test는 이전 STD validation과 같은 농도로 PBS대신 DMSO만을 이용하여 희석하여 비교 진행해봤고, STD는 PBS나 DMSO에서 같은 RT및 area 값으로 문제가 없었습니다. 다만 장시간 autosampler에서 방치한 결과는 DMSO가 안정적이었습니다.

protocol은 4개 약물을 동일한 방법으로 설계하였는데 문제가 되는 약물은 시간 경과에 따른 응집이 다른 약물에 비해 극적으로 심한 것으로 보입니다. 다른 약물들은 이전 실험에서 최대 48시간까지도 문제없이 측정 되었습니다.

초기 sampling에 100% DMSO를 사용하지 못하는 것은 cell membrane에 구멍을 뚫는 DMSO인지라 체내 독성 및 liposome 막구조에 영향이 예상되고, 또한 가급적이면 in vivo와 유사한 환경에서 방출 테스트를 진행하고자 PBS를 사용했습니다.

+)protocol의 validation에 대한 세부적인 절차가 나온 reference가 있을까요? process validation이나 method validation 등에 관한 내용들은 확인했으나 protocol validation에 대한 내용은 찾을 수가 없어서요..