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Q crispr cas9 plasmid 관련 문의

레벨01 타햐 (대학원생)

20.01.20 16:45
조회8911

안녕하세요 현재 crispr cas9 system을 도입하려고 합니다.

특정 receptor를 knock-out시키는 목적이구요

protocol setting 중입니다. 맞는지 알려주세요! 이제 공부를 시작한 학생이라 내용에 대한 이해도가 완벽하지 않습니다. 틀린것도 있을수 있구요. 최대한 답변해 주시면 감사하겟습니다.

실험엔 crispr cas9 knock out plasmid를 사용할 것이구요 2개 vector sgRNA와 Cas9 plasmid를 co transfection 하여 cell안에 넣어서 knock out을 시킨 cell로 실험을 진행하면 되는게 맞나요...?

혹시 co transfection시 cell 양에 따른 plasmid 양을 어떻게 정하는지... cell 양은 2x10^5/well을 할꺼에요

부족한 점이 많습니다. protocol setting 하는데 참고하면 좋을 자료도 올려주시면 감사하겟습니다!

Cell Biology > Transfection

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A 답변 1

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레벨02 지놔가놔지
20.01.21 16:56

실험 목적이 정확히 무엇인지 모르겠습니다. 단순히 In/del을 유도하고 싶으신거라면 한개의 sgRNA만 넣어 frame shift로 KO시켜도 무리는 없을 것이고 아예 그 지역을 통째로deletion 시키고 싶으신거라면 제거할 지역의 양끝에 디자인한 sgRNA를 encoding 하는 vector를 넣어주면 될 것입니다.

gRNA vector와 Cas9 vector를 따로 transfection 해도 되지만 mammalian에서 한번에 작동시키는 all-in one vector를 사용하는 경우도 많습니다. (예 : Thermo사 GeneArt™ CRISPR Nuclease Vector )

protocol을 setting하고자 한다면 각 제품들의 manual을 참고하면 많은 도움이 되실것같습니다.