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커뮤니티  >  실험 Q&A

Q IHC background가 너무 심해요

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레벨01 sang ha (대학생)

  • 19.05.21 11:50
  • 조회2845

IHC 진행중인데 background가 너무 심해서 고민중입니다.

 

secondary antibody만 넣었는데도 형광이 쨍쨍하게 보입니다.

뭐가 문제인지 확인 부탁드립니다.

 

xylene 10min x2

100 EtOH 10min x2

95% EtOH 5min 

70% EtOH 5min 

50% EtOH 5min

tap water 5min

 

antigen retrival(using pressure cooker) 3min with sodium citrate buffer

wash tap water 10min

blocking 5% normal goat serum in PBS 1h

primary ab (dilution buffer 1% BSA in TBS) 4도 O/N in humidity chamber

wash 0.025% tween 20/PBS 10min x3 with agitation

secondary ab(dilution buffer 1% BSA in TBS) 30min at RT with agitation

wash 0.025% tween 20/PBS 10min x3 with agitaion 

 

이렇게 했는데

secondary ab만 넣었을 때도 나오고 488 1:10,000 

594 파장에서는 primary를 추가해서 실험했을때

primary 1:100, secondary 1:1000에서 원하는 결과는 핵에서 보여야 하는데 세포전반적으로 보여서 문제입니다.

어떻게 문제인지 알려주세요ㅠㅠ

Immunology > Immunofluorescence

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A 답변 2

  • 레벨01 신경 (비회원)
  • 19.05.22 09:43

이미지 파일을 첨가하면 답변 얻기 좋을겁니다.

  • 레벨01 IHC전문가는아님 (비회원)
  • 19.05.22 10:26

antigen retrival(using pressure cooker) 3min with sodium citrate buffer

- 저는 cooker에 넣어서 5분이상 끓입니다...

wash tap water 10min

- 30분이상 천천히 식히구요...

그리고 blocking 전단계에 전 detergent 단계가 하나더 들어갑니다

거의 background가 마니 없어지는 것 같네요....

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