SDS PAGE 고수님들 도와주세요!(stacking gel) | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q SDS PAGE 고수님들 도와주세요!(stacking gel)

레벨02 NAIN (대학생)

18.04.04 23:05
조회10288

1522850691386.jpg (다운로드 : 2246)

TEMED제외한 모든 버퍼를 새로 만들어서 사용햇구요. running gel위에 에탄올로 평평하게 맞춘다음 물로 헹구고 페이퍼로 물기도 제거해주고 stacking을 올렸습니다. 버블생김없이 콤도 잘 끼웟고 그위에 추가로 stacking gel을 더 부어주기도 했습니다.
그런데 뭐가 문제인지 gel이 굳으면서 사진과같이 버블이 끼거나 푹 꺼져버립니다. 항상 양옆만 그렇구요. Running. Stacking을 동시에 제조해 놓고 stacking은 이후 10% APS와 TEMED만 넣어주고 사용합니다. 보관을 그냥 상온 실험실 테이블위에 두는데 그동안 문제가 생기는 걸까요...?
1.5mm 판을 사용해 7ml running 굳히는데도 1시간이 걸립니다. 시약을 다 vortexing해서 잘 섞어주는데도... 몇번을 정량 확인하면서 만들어주는데 너무 난감하고 실험 진도가 나가지 않고 있어요ㅠㅠ 실험실 분들도 잘 모르겠다고 처음 보시는 경우라 하셔서...
저와같은 상황을 겪으셨던 분들, 그걸 해결하셨던 분들, SDS PAGE stacking gel에 대한 모든 조언 부탁드립니다!! 참고로 running gel은 잘 만들어져요 ...well이 문제입니다.

Mol. Biol.-Protein > Western Blot

등록순
추천순

A 답변 5

레벨05 Marine
18.04.04 23:15

10% APS 도 상온에 오래 보관하셨나요?
젤이 안굳을때는 대부분 10% APS가 문제인경우가 많아서...
10% APS 문제에 한표 던지겠습니다.
10% APS 는 일주일이상 두지말고 최대한 쓸때마다 만드시고 냉장보관 하는게 좋습니다.!

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨01 아이고 (비회원)
18.04.05 04:27

우리나라 페이지 안되면 무조건 aps탓..
딱봐도 aps 중합 잘 시키는데..
aps가 문제인 경우가 많다는 멘트까지 교육되어져내려옴..
몰르는사람들이 하도 흔하게 들어본게 저거라
아무거나 aps 탓하는데 ㄴㄴ요..

러닝젤 잘 굳으니 aps문제 없고
경험상 aps 상온 3개월도 문제 없음(난 시그마꺼씀, 그래도 양심상 2달 넘으면 새로 만들자)

1. 늦게 굳는거
aps랑 temed 넣는 양을 약간 올려보시면 되고
싫으시면 실험실 온도를 살짝만 높혀도 굳는 속도 빨라집니다.
너무올리지는 마세요 (30도 이상) 중합이 고르게 안됩니다. 느리다싶으면 25 권장

2. 옆구리. 버블 또는 비는거
만져보기 전 원인은 알 수 없으나

추측1.
쇼트 플레이트랑 스페이서 플레이트 사이 규격과 콤 규격이 안맞을 수 있음
콤도 1.5mm용인지 확인해보시오. 보통 우측 위에 써있음.

추측2. 초록색 홀더가 윗부분까지 잘 잡아주지 못하여 벌어지거나 샐 수 있음
조금 더 위를 잡아주고 해보거나
아예 딴 홀더로 교체해보거나
아예 홀더 빼고 문구점에서 파는 은색 철집게로 도배해서 만들어보세요.
(집게쓰는경우 큰거보다 작은거 여러개가 강함)
(사무용 알록달록말고 은색 파로크립 하나에 2 cm정도 하는거 찾으면 됨)

**추가 팁**
스타킹젤 넘치게(술마실때 표면장력) 해두고 콤 넣고 걍 질질 흘린채로 중합하세요
그러면 편함
흘린거는 나중에 잘 닦으면 문제 없어요

그리고 시약들 넣고 나서 섞을때 볼텍싱 하지 말고 손으로 흔들거나 가볍게 탭핑만 하세요
볼택싱하면 거품 너무 많음.

답변리플

레벨05 imperialvet
18.04.05 10:00

아이고 님의 말씀에 동의합니다.
running gel이 굳는걸 보면 APS 문제 때문은 아닌 것으로 보이네요.
running gel 이나 stacking gel의 크기는 굳은 후에는 처음 분주한 양에 비해 상당히 줄어듭니다.
comb이 정상적이라면 (comb의 양 끝이 부러진 경우 plate내로 유입되는 공기를 차단하지 못하여 stacking gel에 상당의 버블을 만듬) 아이고 님의 말씀대로 comb을 살짝 끼운 상태로 stacking gel 용액이 plate 겉으로 줄줄 흘러넘칠정도 (전 약 1 ml~1.5 ml이상)로 넣은 후 comb을 완전히 눌러서 굳혀보세요.

행운을 빌어요.

답변리플

레벨05 Hightop
18.04.05 11:47

Running gel 굳는데 1시간 걸리시나요?
그럼 100% APS 문제입니다. 저는 최대한 국산 시약, 국산 제품을 사용하자라는 생각을 가지고 있는 연구원인데, 그 중에서도 자신있게 남들에게 추천하는 건 덕산화학 APS, 엘피스바이오텍 Gradi-gel II 입니다.(Pre-made gel을 안쓰는 실험실일 경우..)

덕산화학 APS 사용하기 전엔 SDS-PAGE gel 만드는데 시간이 너무 오래걸려서 매우 짜증났습니다. 그러다가 브릭에서 덕산 APS가 좋다는 글을 봤고, 어차피 500g에 5-6천원 하는거 한 번 사서 테스트나 해보자 라는 생각으로 샀습니다. 결과는 어떨까요? 러닝겔, 스타킹 겔 굳는데 한시간 걸리던게 각각 5~8분이면 무조건 굳었습니다.

APS 파우더는 상온에 보관하면서 습기만 안차게하면 되고, 10% APS 용액은 덕산화학 제품 사용했을 때 한 달이든 두 달이든 냉장보관, 상온보관 상관없습니다. 그리고 Comb의 경우는 Running gel이나 Stacking gel 모두 굳으면서 물이 조금씩 빠져나옵니다. 특히 Stacking gel은 넘칠정도로 부어주시고 comb을 꼽아주세요.

덕산 APS 한 번 구입해서 사용해보세요. 겔 만드는 시간 매우 줄어듭니다. 우리에게 시간이란 금과 같으니까요.

답변리플

레벨02 NAIN
18.04.08 12:38
질문자

도움주신 모든분들께 감사합니다!! 다행히 잘 만들어졌습니다!!running gel이 굳는 속도 문제도잇어서 TEMED도 새로 바꾸고 stacking gel 미리 만들지 않고 바로 만들어 사용하니 버릴 well이 하나도 없이 아주 잘됬습니다^^ 제생각에는 아무래도 미리만들어 놓고는 아이스에 보관하지 않아서 그런것 같습니다. 그리고 comb에 테이핑으로 라벨링을 해놧엇는데 혹시나 공기유입때문일까 싶어서 제거하고 끼우니 깔끔하게 된 듯 합니다(테이핑 해놓고 써도 저만 문제가 생겼지만..ㅠㅠ) 온갖소설 다쓰고 고민거리였는데 속이 시원하네요! 답변주신 모든 분들께 감사드리고 팁 잘 간직해서 열심히 실험하겠습니다^^