잘 되었는지 확인하기 위해 gel에 걸어봤는데 마지막 한 개(제일 고농도)가 옅게 나왔습니다. 그 이유는 어떤 것 때문인가요?
>> gel 에 걸어보셨다는 건 합성한 cDNA를 gel 에 걸어보셨다는 것 인가요?
cDNA 합성정도를 cDNA 전기영동을 통해서는 정확하게 확인 할 수 없습니다.
cDNA 전체를 걸면 전기영동 상에서 확인이 될만큼 뚜렷하게 나타나지 않을 것이니까요
차라리 이렇게 확인하시는 것 보다 잘 알려진 Housekeeping gene 을 증폭해보신뒤 전기영동으로 차이가 안나게 증폭이 균일하게 되었는지를 확인하시는것을 추천드립니다.
또한, 정량을 맞추어서 cDNA 를 만들었음에도 불구하고 차이가나는것은 상당히 많은 이유가 있을 수 있습니다.
RNA의 퀄리티는 거의 다 동일한 수준 이었는지, DNA contamination 은 어떻게 처리 하였는지
정량은 어떤장비로 하였는지 등.. spectrophotometer 말고 Qubit 과 같은 다른장비로 정량을 할수 없는 상황이라면, gDNA contam 을 반드시 확인하시고, DNAse 처리 등으로 제거를 해 주셔야 정확하게 정량 가능합니다.
