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1.cell stock 만들 때와 풀 때, 2.cell 모양에 관해... 3. Cell 뭉침?

레벨1 cell ()

등록일 2015.04.27 13:11:32
조회8780

cell stock으로 만들 때 10파이 plate 꽉 찼을 때
5ml에 cell을 풀어서 원심분리 후 pellet을 1mL (5DMEM:4FBS:1DMSO)에 풀어
1. stock만드는 tube에 넣어 1개를 만듭니다. 그리고 -80도 하루 보관후 LN tank로 옮깁니다.

그리고 stock을 풀 때 1mL stock을 상온에 녹여 5mL DMDM에 풀어 원심분리 후
pellet을 3ml DMDM에 푼 후 10파이 plate DMEM 10mL과 함께 섞어줍니다.

즉 꽉 찬 plate 1개로 stock 1개를 만듭니다.
그리고 stock을 풀 때 1개의 plate에 풉니다. 이렇게 하는 것이 보통 맞는 것인가요?

2. 그리고 cell을 trypsine처리하여 haemacytometer로 하는 경우 cell이 모두 동그란
모양인데 cell이 바닥에 붙은 경우 마치 혈소판 모양처럼 자라는데...
이게 어떠한 차이인가요?

3. 그리고 cell을 transfection이나 sub culture 시 cell을 pipetting으로 plate 벽에 때려 cell을
푸는데 ... 이 과정을 왜 해주는건가요 ?
cell 이 뭉쳐자라면 cell 성장에 안좋은가요?
transfection 시 cell 이 뭉쳐있으면 DND가 잘 안들어간다는 것은 이해하겠습니다....
그런데 sub culture 시에는 왜 풀어주는지 잘 모르겠습니다.

4. 그리고 cell 이 plate에 꽉 차는 경우 그 상태로 계속 키우면 안되는 이유가 무엇인가요...?

기본적인 cell 실험을 하고있는데...
궁금증이 정말 많은데 ... 선배들과 교수님 모두 cell 실험 경험이 없어서 어렵습니다.
도움 부탁드립니다.

#cell
#sub culture

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답변 2

답변등록

레벨2 마모트
2015.04.27 15:05

1. 일반적으로 hela cell의 기준으로 한 plate 크기 당 cell 적정 갯수의 메뉴얼이 있기는 합니다만.. 한 플레이트당 cell의 크기에 따라 개수도 틀려져서 적정 cell number의 정확한 메뉴얼은 cell을 가져오신 히스토리가 있는 메뉴얼을 보고 cell counting을 하셔서 키우는게 좋습니다. stock이나 backing을 할때의 기본적인 툴은 그것이 맞구요 그때도 cell counting을 해줘서 cell의 갯수를 적정하게 분배하여 banking 하는것이 좋겠지요

2. cell이 바닥에 붙어있을때는 collagen 이라던가 fibronectin 같은 물질들로 cell간의 결합이나 plate-cell 간의 결합 matrix를 구성합니다. 그래서 팔을 뻗고있는 형상이 되죠.. trypsin 처리를 하면 이것들이 바닥에 붙어있는 물질과 셀들을 결합하고 있는물질들을 분해시켜줌으로써.. 세포마다 그 정도가 다르긴 하지만 single cell로 떨어뜨려줍니다. 세포는 결합하고 있는 지지대나 바닥 및 세포들이 없으니 보여지는 morphology는 구형으로 보이는겁니다.

3. 계대배양시 일정한 농도로 새 plate에 seeding을 하려면 aggregation 되는 셀이 없이 single cell로 골고루 media에 퍼지는것이 유리합니다. 예를들어 설탕을 물에 풀었을때 뭉친부분이 있으면 옮겨 담을때도 이쪽은 농도가 옅고 덩어리 진 부분은 진하고 이러한 문제가 생기겠죠? plate 벽에 때리는 과정은 trypsin 처리를 해도 plate 에 붙어있는 cell들을 물리적으로 떼냄과 동시에 cell 들을 single cell로 풀어주는 역할을 합니다. cell이 뭉침을 aggregation 이라고 하는데 이것은 cell growth에 당연히 안좋습니다. 왜냐하면 aggregation clot의 표면에 있는 cell들은 media와 맞닿아 있고 노출되어있어서 호흡하는데도 문제가 없지만 그 속에 있는 cell들은 영양분 공급과 호흡을 하지 못해서 다 죽고맙니다. 그래서 seeding 초기에도 plate가 기울어지면 cell들이 한쪽으로 쏠림이 발생하여 뭉쳐 자라기 때문에 고른 spreading 에 신경써서 seeding 해야 합니다.

4. overgrowth 라고 하는데 한플레이트에서 cell이 적정 수준을 넘어 자라게 되면 cell morphology 뿐만 아니라 그 고유의 특성까지 변하게 됩니다. 쉽게 말해서 mutation이 일어나는 것이죠. overgrowth가 되지 않게 적정한 cell number을 맞춰서 계대를 해주는것은 아주 중요한 일입니다.

글쓴이 (비회원)
2015.04.27 19:11

와..... 정말 감사합니다
모든 것을 속시원히 해결해주셨어요 !
따로 선배님께 배우고싶을정도입니다 감사합니다 ....

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