qPCR에 관해 여주어봅니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q qPCR에 관해 여주어봅니다.

레벨05 캐틀

14.06.23 14:23
조회4906

qPCR 조건에 대해 몇가지 고수님게 여쭈어 봅니다.

얼마전 qPCR primer, probe를 제작하였는데... primer랑 probe의 Tm 값이 많이 차이가 납니다.

primer의 Tm값은 F/R 모두 66.5도로 디자인 하였으나, probe는 77.7도 로 디자인 되었습니다.

이에 qPCR 시행시 온도를 어디에 기준을 두고 맟춰야 하나요????

66도로 맞추자니 probe가 binding 하지 않을것 같고, probe에 맟춰 실험하지나 primer쪽이 걸리네요...

이럴경우 고수님들은 어디에 기준을 두고 조건을 잡으시나요???

한가지 더 여주어보면, qPCR전에 qPCR primer로 conventional PCR을 시행하고 PCR 산물을 이용하여 qPCR의 template로 하고 primer 없이 probe만 넣고 실험을 진행 한다면 예상 되느 ㄴ결과는 어떤것 일까요??? signal 확인이 가능할 까요?? 예상으론 약 200bp정도의 PCR산물이 주형이 되니 specific probe만 넣고 (primer 없이) 실험한다면 signal을 확인 할 수 있지 않을까 하는데... 고수님의 의견은 어떠신지요???

혹, taq polymerase를 일반적으로 쓰는 polymerase가 아니라 다른 특수한 polymerase가 필요하진 않을 까요???

Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR

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레벨08 엘피스
14.06.24 09:33

여러개의 primer를 쓰는 경우, 가장 낮은 Tm값을 가지는 primer를 기준으로 해야 합니다.
66C에서는 probe를 포함한 모든 primer가 붙지만 70C를 넘어가게 되면 probe만 붙습니다.

Taqman방식의 qPCR은 Taq pol의 3' to 5' exonuclease에 의해 probe가 깨지면서 나오는 형광의 쎄기를 측정하는 방식입니다. probe만 넣고는 signal의 변화를 볼 수 없습니다.