안녕하세요 Western 초보입니다. 실험을 하면 background가 나오고 band 가 전체적으로 흐리게 나오더라구요. 원인에 대하여 찾아보니 단백질양이 적거나 antibody quality가 안좋거나 이럴경우 흐리게 나오고 background는 washing 이나 detection 문제일 경우가 많다고 하더라구요 저희는 ECL solution A,B 1ml씩 섞어서 membrane 재빨리 흔든다음 위에 뿌려주고 찍습니다. detection 의 경우가 문제라면 어떻게 하는게 좋을까요???ㅜ,ㅜ 고수님들 조언 부탁드립니다ㅜㅜㅜ
항체를 BSA에 희석하지 말고 blocking solution (milk)에 희석해 사용해 보세요. BSA는 signal은 좋지만 non-specific binding이 아주 높게 나오는 경향을 보입니다. 더군다나 권장 titer가 1:200 밖에 되지 않는 허접한 항체를 사용할 때는 BSA의 사용은 더 않좋습니다.
그리고 blocking을 한 후에 wash하고 1차 항체를 처리해 줄 필요는 없습니다. 또한 primer가 아니라 일차를 의미하는 primary antibody가 맞는 표현입니다.
