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(비회원)
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2013.12.23 10:55
1. 안티바디의 농도가 높을 경우에 비특이적인 결합이 일어날 확률이 높습니다.
2. 2차 안티바디의 활성이 떨어질 경우 non specfic한 binding이 일어날 확률이 높습니다.
3. exposure time을 매우 오래할 경우에 위와 같은 결과가 나올 확률이 높습니다.
4. blocking solotion의 농도를 높여주면 background를 낮춰주는데 도움이 됩니다.
5. target protein의 band를 잡았다면 protein의 양을 줄여주는 것도 하나의 방법이 될 수 있습니다.
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음.
(비회원)
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2013.12.23 11:05
타겟을 못잡고 있는거 같네요'ㅅ'
다 똑같은거 같은데
갭디에치 같은건 미친듯이 잘나오는 아이인데;;
다른 컨트롤로도 잡아보세영 튜불린이나 엑틴같은..
타겟을 못잡고 있는데 디벨럽 시간이 길어지면 백그라운드가 뜸니다 ;ㅅ
폰슈로 염색한거마냥 예뿌게 잘나왔네요'ㅅ' 정량에는 문제 없어 보임니다ㅎㅎ
프로테인 양을 늘려서 한번 확인해보세여
얼마나 걸어주신건지???
샘플에는 문제 없는지 확인해보세영 ㅎㅎ 로딩은 잘 된거같구 정량도 문제없는거같고..
아니면 에초부터 타겟이 벡터에 제대로 들어갔는지 확인해보셔야될듯??
저도 실험 초창기에 타겟 디텍션이 안되서 뭐가문젠가 했더만
벡터 시퀀스가 밀렸더라구요 ㅋㅋ 단백질이 아예 따른놈이 들어가있으니
디텍션이 안됬을지도 몰라여 ㅎㅎ
항체를 BSA에 희석하지 말고 blocking solution (milk)에 희석해 사용해 보세요. BSA는 signal은 좋지만 non-specific binding이 아주 높게 나오는 경향을 보입니다. 더군다나 권장 titer가 1:200 밖에 되지 않는 허접한 항체를 사용할 때는 BSA의 사용은 더 않좋습니다.
그리고 blocking을 한 후에 wash하고 1차 항체를 처리해 줄 필요는 없습니다.
또한 primer가 아니라 일차를 의미하는 primary antibody가 맞는 표현입니다.
윗분 말씀처럼 우유에 다일루션 시켜서 써보세요
우유로 블락킹을 하고 우유로 붙이는게 일반적으로는 좋슴니다
(물론 상관없이 잘 잡히고 안된다는건 아니지만..)
블락킹 후에 워시는 안해줘도 되는과정같구요..
50ug이면 엄청 많이 거시는거 같은데..
안티바디를 1:200으로 치시나요?? 이해가 잘 안되는데
농도나 권장량을 단위에 맞게 한번더 확인해보심이..
