제가 갖고 있는 vector plasmid에서 알맞은 primer 제작 후 Amplification(1)으로 Insert 얻은 후 t-vector 거쳐서 target vector로 cloning 완료 후 갖고 있던 primer로 최종확인 차 PCR을 진행하였는데 (positive control로 1) 을 넣어 같이 PCR 진행함)
Positive에서는 제대로 된 것을 볼 수 있었는데.. 기타 cloning을 한 군들에서 잡밴드가 많이 보였습니다..
t-vector 거친 후 colony (white) inoculation-DNA prep.하여 double cut 한 결과 insert가 제대로 들어간 것을 확인할 수 있었는데요..
target 으로 하는 vector에 ligation 후 colony 깔끔하고 통통하게 떠서 picking 여러개 해서 DNA Prep. 후 PCR 결과가 ... 제대로 된 size에 뜬 것 포함해서 band가 너무 많이 떴습니다...
저의 경우이니 참고해주시면 고맙겠습니다. PCR은 기본적으로 Error를 항시 포함하는 과정입니다. 저는 PCR TA cloning 후에 4개나 3개의 white colony를 따서 LB나 2YT에 키운후에 플라스미드 프랩하고
반드시 시퀀싱을 보냅니다.
시퀀스상에서 에러가 없는 그중에 하나를 선택하여 원하는 엔자임으로 잘라서 최종 벡터에 클로닝합니다.
엔자임으로 자르고 붙이는 과정에서 DNA 서열상의 에러가 발생할 확률은 거의 없기 때문에 PCR과정이 아닌 자르고 붙이는 과정을 확인하는데는 엔자임 커팅& 사이즈 확인으로 클로닝 여부를 확인하고 구지 시퀀싱은 하지 않습니다.
PCR 확인하실때 잡밴드가 너무 많이 뜨신다면 Primer seq가 맞는지 Annealing Temp. 가 너무 낮지 않은지 확인을 해보세요. 그리고 피씨알의 네거티브 컨트롤 (프라이머 둘다 안넣고 물만 넣은경우, 프라이머 한쌍씩만 넣은경우)를 같이 PCR을 해보세요. 네거티브에서 밴드가 안떠야 정상입니다.
