제품번호 : 50494
LSM- Lymphocyte Separation Medium
사용목적 :
peripheral blood 로부터 lymphocytes를 분리할 때 사용 (mononuclear lymphocyte 분리)
배경 :
초기 leukocytes를 분리하는 방법은 특정 compound를 blood에 섞어서 erythrocytes를 응집시키는 방법으로 진행되었으며, 원심분리 진행 시 erythrocyte는 density 증가로 인해 pellet으로 가라앉고 leukocytes만 튜브의 상층액 부분에 분리되어 수거하는 방식으로 사용됨.
Boyum 은 Ficoll-sodium metrizoate solution으로 원심분리 하는 방법을 사용하여, 좀더 편리하고 빠른 분리방법을 소개함. 희석된 혈액을 Ficoll-sodim metrizoate solution의 상부에 첨가하고, 낮은 속도로 짧은 시간 동안 원심분리하게 됨. Erythrocytes 와 granulocytes는 튜브의 바닥에 침전되며, mononuclear cells (lymphocytes) 와 platelets은 두 층 사이의 경계면에 모이게 됨
Reagent 특성 :
LSM은 sterile filtered solution으로 100ml 당 6.2g의 Ficoll과 9.4g의 sodium diatrizoate 로 구성됨
Density는 20°C에서 약 1.07700.1-1.0800g/ml 임
실험방법 :
1. LSM을 사용 전에 잘 섞어줌
2. 무균상태에서 LSM 3ml을 15ml centrifuge tube로 옮김
3. Defibrinated 또는 heparinized blood 2ml을 physiological saline (ex. PBS) 2ml 과 섞어줌
4. 희석된 blood 를 LSM 3ml 이 들어있는 centrifuge tube로 조심스럽게 옮김 ( 섞지말것)
5. 실온에서 400Xg로 15-30분간 원심분리.
(층 형성 순서 : plasma layer à mononuclear cell layer à LSM layer à RBC pellet)
6. 상단의 투명한 plasma layer를 lymphocyte 층의 약 2-3mm 위까지 제거
7. Lymphocyte 층과 LSM 층의 반 정도를 수거하여 깨끗한 centrifuge tube 로 옮기고, 동량의 buffered balanced salt solution을 첨가. cell에 영향을 주지 않으면서 cell만 가라앉을 수 있는 속도로( 예, 160-260xg) 실온에서 10분간 원심분리 ( LSM 제거 및 platelet의 농도를 낮추기 위한 목적임)
8. Cell을 buffered balanced salt solution으로 한번더 wash 해 준 후 적절한 medium에 re-suspension 하여 사용
출처URL : http://www4.mpbio.com/ecom/docs/proddata.nsf/(webtds2)/50494
