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단백질 추출 니켈컬럼(Ni column)에 관한 질문입니다.

레벨1 헤리 ()

등록일 2013.04.01 14:01:34
조회4950

안녕하세요 현재 대학원에 입학한 석사 1년차입니다....^^
현재 니켈컬럼을 이용하여 단백질을 추출하는 실험을 하고있습니다. 그런데 sonication후 sup을 Binding buffer와 섞은후 컬럼에 내리고 washing 하고 Elution 하면 단백질이 농도가 계속 Binding buffer에 높게 나타납니다.
(Binding에서 loss가 너무커서 elution buffer에서는 나오지 않습니다.)
sonication부터 하는 과정이랑 buffer condition 올립니다. 조언좀 부탁드릴께요
(벌써 4번째실험인데 정신적 압박이 커지네요 ㅠㅜ) ->제생각으로는 His tag이 니켈 bead에 붙지 않은것 같아요 buffer condition도 확인좀 부탁드립니다 .... 감사합니다.

1) incubation :sample + 1X PBS 10ml, + 10mg/ml lysozyme 250㎕, 30min 4℃(ice)

2) sample volume 30ml (total volume 33ml)

: sonacation한 cell 10ml + 1X PBS 5ml + 1% Sarcosyl 15ml + 10% Triton X-100 3ml

3) incubation : 4℃(ice), 30min

4) centrifugation : cell room 4000rpm, 30min

⇒ 상층액에 protein 있음, pellet(sonication 잘됐으면 검은색)

5) resuspension : pellet + 1X PBS 보관

*Na2HPO4 (50mM) + NaCl (0.5M) →base buffer 가됨

*binding buffer (5mM) 50ml x3, washing buffer (50mM)50ml x3, elution buffer (400mM) x1

→imidazol로 buffer 농도 맞춘다.

1) Binding X 3(sup 섞어서) → Washing X 3 → Elusion 순으로

#elution
#column
#니켈컬럼

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답변 4

답변등록

레벨8 강시
2013.04.01 18:33

히스택은 보통 N-terminal에 붙이지요.
그런데 경우에 따라서는, 단백질에 따라서 종종 이 히스택이 단백질 구조속으로 접혀들어가는게 아닌가 싶어요.
그래서 c-terminal에 히스택을 붙여서 해결하곤 합니다.

레벨1 헤리
2013.04.02 11:46

답변감사드립니다.^^
혹시 제가 setting한 실험 condition이나 순서는 잘 못 하고 있는 것이 없나요???

레벨2 dlzkfmxm
2013.04.02 14:45

*binding buffer (5mM) 50ml x3, washing buffer (50mM)50ml x3, elution buffer (400mM) x1

→imidazol로 buffer 농도 맞춘다.

여기에서 binding bf(5mM)이라 함은 imidazole이 5mM이란 말씀이신지요??
혹시 target protein이 5mM imidazole에서도 elution이 되는건 아닌지..
저는 sample bf에는 imidazole을 넣지 않고 진행합니다.
FPLC등을 이용하여 imidazole농도에 따른 gradiant로 정제를 해보신다면 더 확실해 지겠네요~

레벨1 헤리
2013.04.03 13:45

아 글럴 수도 있겠습니다...Binding buffer에는 imidazol을 넣지 않고 실험을 해보아야 겠습니다
답변 감사드려요~^^

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