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western 5x SDS page loading buffer

buffer (비회원)

등록일 2012.03.20 11:23:24
조회12900

5x SDS page loading buffer를 만들었습니다.

그럼 sample이랑 1:4로 섞어서 100도 에서 5분 끓이고 아이스에 넣어 두었다가
loading 하면 되는거죠?

그러니까 만약에 protein 을 10ug으로 쓴다고 할때 sample A가 5ul 들어간다면
5x buffer를 1ul 넣어서 끓이고 total 6 을 loading 하면 되는건가요??

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답변 3

답변등록

레벨1 풍금
2012.03.20 13:09

5 X buffer란 농도가 5배이므로 1/5 희석하여 사용하라는 뜻이지요

tot 6ul 부피로 사용하면 1/6 이 됩니다.

그러니 sample 4ul 에 laoding buffer 1ul 를 넣어야 1/5희석이 되죠

엘피스바이오텍 (비회원)
2012.03.20 14:55

4ul sample에 1ul가 맞습니다. SDS-PAGE에서 loading buffer는 Tris의 농도가 중요하기 때문에 DNA loading buffer처럼 대충 넣고 하면 미세한 차이지만 문제가 생길 수 있습니다.

Boiling후 원심분리하여 녹지 않은 물질을 떨어뜨리고 loading해야 합니다. On ice과정은 boiling한 단백질에서는 의미가 없습니다.

Wanderer (비회원)
2012.08.22 13:11

답변이라기엔 질문시와 시일이 많이 자나서 민망하지만, 차후 검색으로 보실 분을 위해 몇자 적습니다.

일단 10ug sample 5ul가 있는데 5X sample buffer얼마를 넣느냐가 질문의 요지라면,

정확히 5X sample buff. 1.25ul만 넣어서 진행하시면 됩니다.

윗분들 처럼 "4ul만 써라"라고 하면 실제 들어가는 단백질의 양은 10ug보다 줄어들겠죠?

그리고 ice cooling이 필요없다는 답변도 있는데, 어떤 의미에서 그런 답변을 하셨는지 궁급합니다.
이 과정은 실험에 큰 영향을 주는 과정은 물론 아닙니다만, 좀 더 정밀한 실험을 위해서는 필요한 step이지요.
더붙여 ice cooling후 반드시 spin down하고 상층액만 사용하셔야 합니다.

늦은 답변에 길어져서 죄송합니다.

좋은 결과 바랄께요^^

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