우선 Genome을 PCR 해서 얻은 산물이 Intron이 없이 cDNA가 증폭이 되는 것은 맞지요?
맞다고 생각하고 답변합니다.
Stop codon이 His-tag 앞에 있는지 확인, reading frame 확인
우선 Small scale (1 ~ 5 ml) 정도 배양하여 세포를 모은 다음 활성 측정이 가능하면 활성측정하여 보시고, 활성이 없는 단백질이면 His-tag Ab 등으로 발현 여부를 확인하십시오 (Ab가 있다면 Ab로). (transformation 한 것과 안한 것을 함께 비교, 그리고 pellet과 상청액 모두 확인)
필요하다면 Ni-resin 조금 넣어서 test 해 보아도 좋습니다.
목적 단백질이 많이 발현되지 않으면 생체 내에는 histidine 등 N을 가지고 있는 아미노산을 가진 단백질이 많습니다. 많이 붙어 나오겟지요. 내 단백질이 발현이 많지 않으면 엉뚱한 Band가 아주 많이 나옵니다. 발현량이 낮으면 resin을 아주 줄여야 합니다. 목적 단백질과 다른 단백질이 경쟁적으로 결합하니까?
rbs와 ATG 사이는 문제가 되지 않을 것 같습니다.
그리고, resin이 의심이 간다면 resin을 일부 따서 SDS Sample buffer 넣고 끓인 다음 loading 해 보세요. resin에 붙어 있을 수도 있으니까요?
실험에 대하여 방향을 잡으신 듯하여 일반적인 이야기만 하였습니다.
