gel에서 band 위치에 따라 진하기가 달라집니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q gel에서 band 위치에 따라 진하기가 달라집니다.

레벨05 로소

11.01.26 14:53
조회6945

중간쯤에 band를 확인 했을때엔 엄청 진하게 나왔는데요,

marker band가 뭉쳐 있어서 조금 더 내려본다고 내렸는데,

band 진하기가 중간에서 확인한것과는 비교 할수 없을 정도로 흐릿하게 나옵니다..

one band 라서 다른 band가 끼이거나 그러진 않은거 같은데...

도저히 모르겠습니다..

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A 답변 3

레벨01 엘피스바이오텍 (비회원)
11.01.26 15:03

gel이 편평한 경우, DNA는 이동하면서 윗표면으로 조금씩 손실됩니다. 따라서 전기영동을 하면 할 수록 농도가 떨어져 흐리게 보이게 됩니다. 1kbp와 100bp를 동량으로 loading한후 나중에 보면 100bp가 같은 양임에도 불구하고 현저히 흐려보이는 이유가 이것입니다.

한가지 이유를 더 대면, EtBr은 DNA와 반대방향으로 움직입니다. DNA와 결합된 EtBr이 gel상에서 잘 떨어지는 것은 아니지만, 상대적으로 EtBr의 농도가 낮아져 좀더 흐리게 보일 수 있습니다.

Gel을 만들때 아랫부분을 좀더 두껍게 만들거나 buffer를 gel의 표면보다 약간 낮게 넣어 전기영동하면 이러한 현상을 그나마 개선할 수 있습니다.
Vertical gel을 사용하는 경우에는 이러한 현상이 전혀 없습니다.

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레벨05 Kim
11.01.27 01:39

Gel을 etbr 없이 만들고, sample 내린 다음에 따로 staining해주는 방법도 있어요.

답변리플

레벨05 animanga
11.01.27 12:41

EtBr의 손실이 더 큰 요인인 것 같습니다.

EtBr은 위(cathode)로 이동하고, DNA는 아래(anode)로 이동합니다.

EtBr이 DNA와 결합하여 saturation되어 있는 상태는 EtBr pool의 끝부분이 DNA와 만나는 지점까지입니다.

그 뒤로는 DNA와 붙어있던 EtBr이 일정부분 다시 gel로 빠져나가기 시작합니다.

따라서 gel running을 지속하면 할수록 band intensity는 약해지기 마련입니다.