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protein overexpression에서 solublilty좀 높일수 있을까요..?

레벨1 고미

등록일 2010.10.28 12:18:20
조회7749

대학 석사과정중에 있는 대학원생입니다. 제가 현재 lipase를 과발현 하기위해서 pET28-a와 BL-21을 사용하여 cloning과 transformation을 마치고 IPTG induction까지 확인한 상황입니다.
그런데 단백질이 soluble하고 나오는지 아니면 inclusion body로 나오는지 확인하기위해 IPTG를 넣어주고 harvest한 후 sonication하여 원심분리후 supernatant와 pellet을 각각 SDS를 걸어보았습니다. 결과는 둘다 원하는 단백질이 나오긴하는데 대부분 inclusion body로 떨어지네요..
이처럼 solubility가 낮아서 현재 solubility를 높이는 조건을 찾고있는데 잘 되지않습니다.
처음엔 1mM IPTG를 넣고 4시간동안 37도 250rpm으로 배양한뒤 TEST를 했을때 solubility가 낮아서 이번엔 0.5mM IPTG를 넣고 4시간 30분동안 25도로 배양하여 TEST했으나 여전히 solubility가 낮게 나오네요.. 제가 알기로는 온도와 IPTG농도가 영향을 준다기에 낮추어보았지만 여전히 대부분이 inclusion body로 떨어집니다..; 경험이 많으신 분들 노하우 좀 알려주세요ㅕ^^;

<실험 조건>
단백질 크기 : 약65KDa (단백질크기가 너무 큰가요? 65KDa정도면 어떻게 하는게 좋을런지..)

1. 1mM IPTG / 4시간동안 37도 250rpm / harvest / TE-buffer를 넣고 vortexing하여 현탁후 30초간격으로 20초간 3회 sonication실행 / 원심분리 / supernatnat와 pellet 각각 sample buffer를 넣고 88도 boiling후 SDS전기영동 => inclusion body로 대부분 떨어짐

2. 0.5mM IPTG / 4시간동안 25도 250rpm / harvest / TE-buffer를 넣고 vortexing하여 현탁후 30초간격으로 20초간 3회 sonication실행 / 원심분리 / supernatnat와 pellet 각각 sample buffer를 넣고 88도 boiling후 SDS전기영동 => 첫번째 보다는 줄었지만 inclusion body로 대부분 떨어짐

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현재 다른 조건으로 계속 해볼 예정인데 위의 실험과정에서 solubility를 높일 수 있는 부분이 있다면 피드백 좀 부탁드릴께요~
incubation온도와 시간, 그리고 IPTG농도 외에 solubility를 높일 수 있는 과정이 있을까요?
혹시 sonication과정이나 boiling과정 중에도 inclusion body로 많이 떨어질수가 있는지 궁금합니다~ 경험많으신 분들 incubation온도와 시간, IPTG농도, sonication시간 등 피드백 좀 부탁드려요~

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답변 3

답변등록

TX (비회원)
2010.10.29 13:05

1. IPTG 농도를 줄입니다.
IPTG는 1mM에서 0.5mM로 줄이는 것은 차이가 거의 없을겁니다. 0.05 mM 를 써보세요
2. 온도를 낮춥니다.
IPTG 넣기 전까지 37에서 키웁니다. 그리고 온도를 낮춘후에 IPTG를 넣습니다.
온도는 실온에서 일단 3시간 정도, 또는 16도시에서 overnight
3. OD600 값을 변경합니다.
IPTG넣기전 OD600은 일반적으로 0.7 전후가 좋습니다만..
그 값을 0.4~0.5 또는 0.9~1.0으로 나눠서 해보세요..
4. induction 시간을 줄입니다.
실온에서 1시간 30분 이하로 줄여봅니다. 이때 OD값이 높은게 좋을수도(0.9~1.0) 있습니다.. (?)
5. Lysis buffer에 Triton X-100(물론 다음 실험에 영향을 준다면 안되지만..)을 1% 넣습니다.
   그리고 현탁액을 -20도에 얼려서 하루 보관후, 다음날 녹여서 sonication 합니다.

* 단백질에 대해 별 아는 것은 없지만, 그래도 꽤 오랫동안 실험실에 살다 보니 몆자 써봤습니다만..위의 방법이 님의 단백질에서 적용되지 않을수 있습니다..그냥 참조하시길...-.-;

biogirl (비회원)
2010.10.29 16:09

soluble 발현을 높이는 것으로 알려진 tag들을 단백질 말단에 붙여서 발현시킵니다.
MBP( maltose binding protein) 또는 NUS tag등을 fusion 하여 발현시키거나 발현 숙주를 바꾸어 봅니다.

UTSW (비회원)
2010.10.30 01:34

시간이 걸리겠지만 insect cell로 하세요. 확실합니다. 박테리아로 조건잡는 시간과 돈과 frustration 합치면 insect cell로 바로 옮기는게 속편할 듯 싶습니다.

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