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Cre/Lox 의 개념 좀..

레벨1 초보자 ()

등록일 2009.09.09 03:17:52
조회41587

안녕하세요? 실험 초보자입니다. 적어도 제가 관련된 분야를 보면 요새 좋은 저널의 논문들은 in vivo Cre/Lox model을 기본적으로 사용하고 있더군요. 그런데 한가지 도저히 이해가 안되는 부분이 있어 질문 드립니다. 아직 우리 실험실에서는 경험이 없어서 알고 계신 분들이 없더라고요..

제가 여기저기 search 하여 파악하기로 -잘못 된 부분은 지적해 주십시오.-
특정 cell type의 promoter에 연계되어 Cre를 발현하는 Cre mouse와 특정 gene을 flox 시킨 Lox mouse 가 있고 이를 교배하여 궁극적으로 원하는 type의 cell에서만 특정 gene이 knock out 된 mouse를 만들 수 있다고 알고 있습니다.

그렇다면 교배 후에는 Cre 및 Lox에 대해 각각이 heterotype이 되는 것이 아닌가요?
곧 교배된 Cre/Lox mouse의 target cell을 보면 Cre의 경우에도 Cre/WT, Lox의 경우에도 flox/WT 이렇게 되는 것이 아닌가요?? 그리고 그 cell에서는 결국 특정 gene에 대해 -/WT 의 heterozyge가 되는 것으로 파악했는데요.. (왜냐면 target이 되는 특정 gene에 대해 flox/WT 이이까 flox된 한 쪽 chromosome만 Cre recombinase에 의해 잘려 나가서..)

결국 target이 되는 gene에 대해 heterozygote와 WT homozygote를 비교하여 data를 얻는 거구나! 라고 생각했었습니다..

한데 실제 논문을 보면 (예를 들어) SM22alpha-cre:Ctnnb1 flox/flox 라고 되어 있는데요 (여기서 SM22alpha가 smooth muscle specific protein 이고 Ctnnb는 beta-catenin의 약자로 사용되었네요.) 그리고선 result에서 Ctnnb1 flox/+ 와 Ctnnb flox/flox를 비교하여 data를 보여주고 있습니다. 곧, Ctnnb1 이 heterozygote로 knock out 된 것과 homozygote로 knock out된 것을 비교한 건데요... 이게 뭥미??

요약컨대,
1) 어떻게 flox/flox로 homozygote인 mouse에서 Cre를 이용해서 둘다 knock out시킬 수가 있는지요? Cre mouse와 교배하면 flox/WT 인 heterozygote만 생기는 것 아닌가요??

2) 그리고 Cre/lox in vivo model에서 일반적으로 control로는 무엇을 사용해야 하는지요? 위 논문처럼 Ctnnb1 flox/+ 와 Ctnnb flox/flox를 사용하는 것이 맞는지 (gene에 따라서 이들 둘 간의 차이가 크지 않은 경우가 꽤 있을 것 같은데..) WT mouse를 Cre mouse와 교배하여 Cre는 발현하지만 flox된 gene은 없는 mouse를 사용하는게 맞는지.. 제 생각에는 후자가 더 적절한 control이 아닐까 싶은데 말입니다.

한참 뒤져봤는데 잘 이해가 안됩니다.. 실험의 기본 개념이 이해가 안되니 정말 답답하고, 한심하고.. 논문을 읽어도 나 혼자만 이해 못하는 것 같고.. 하여간, 알고 계신 선생님들의 좀 자세한 설명을 부탁드릴께요.

미리 감사드립니다 ^^

#cre
#lox

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답변 4

답변등록

Cre (비회원)
2009.09.09 05:36

1. 일반적으로 Cre/loxP system 으로 conditional knock-out 을 하는 경우 다음 순서의 교배과정을 거칩니다.
     F1: Cre x flox/+
     F2: Cre; flox/+ x flox/flox
   F3: Cre; flox/flox (mutant) and Cre; flox/+ (control)

즉, 생각하신대로 첫번째 교배만 거친다면 실험용으로 쓸수있는 쥐를 얻는 것이 아니고 결국 삼세대에 가야만 비로소 실험용 쥐를 얻게 되는 것이지요.

2. 그리고 개인적으로는 위에서 언급한 것과 같은 Cre; flox/flox (mutant) and Cre; flox/+ (control) 조합보다는 Cre; flox/- (mutant) and Crel flox/+ (control) 이 더 정확한 비교의 대상이라고 보여집니다. Conventional knock-out 이 있는 경우 "Cre" x "+/-" 를 통해 얻은 쥐를 다시 "flox/flox" 와 교배시켜서 얻는 것인데, heterozygote 의 phenotype 이 없다면 이렇게 하는 것이 genetics 실험의 정석입니다. 만약에 "null allele" 이 없는 경우는 flox/wt mouse 를 ubiquitous Cre mouse (ex. TK-Cre, EIIa-Cre) 와 교배시켜 발생단계에서부터 floxed allele 이 null allele 이 되도록 할 수도 있지요. 이렇게 하는 이유는 Cre recombinase 가 작용해야하는 genomic locus 숫자를 동일하게 하여 혹시라도 생길 수 있는 mosaicism 에 따른 결과의 variation 을 방지하고자 함입니다. 또한 많은 논문들이 cre 가 없는 쥐들을 뭉뚱그려서 control 로 쓰기도 하는데 대부분의 Cre mice 가 transgenic mouse (not gene targeted mouse) 라서 Cre recombinase 의 toxicity 에 대해서도 고려를 해야합니다. 즉 Cre carrier 자체의 phenotype 이 있을 수도 있다는 얘기지요 (예. Nestin-Cre: Forni PE, Scuoppo C, Imayoshi I, Taulli R, Dastrù W, Sala V, Betz UA, Muzzi P, Martinuzzi D, Vercelli AE, Kageyama R, Ponzetto C (2006) High levels of Cre expression in neuronal progenitors cause defects in brain development leading to microencephaly and hydrocephaly. J Neurosci 26:9593-9602.).

실험을 정확히 하려면 알고 계시는대로 그 비교대상이 되는 control 을 그만큼 신중하게 선택해야하는데 가능하다면 Cre alone (제안하신대로), Cre; flox/+, wt, flox/+ 등등 다 살펴는 봐야 제일 좋겠지요. 대부분 그렇게 까지 하는 논문은 찾기 힘들지만 간혹 method section 에 다 비교했는데 비슷해서 통틀어 control 로 하기로 했다는 얘기가 나오기도 합니다.

도움이 되셨으면 좋겠습니다.

초보자 (비회원)
2009.09.09 07:46

아하! 명쾌한 답변 정말 감사드립니다.. 며칠 째 이 문제로 답답해 하고 있었는데, 한 번에 해결이 되네요 ^^ 감사감사..
특히 control과 관련하여 Cre; flox/- (mutant) and Crel flox/+ (control) 의 개념은 정말 생각해 보지 못했던 문제인데, 새로이 깨달았네요.. 그렇게 까지 세심하게 control을 잡아야 하는 것은 미처 생각치 못했습니다.

그런데 염치없이 한가지만 더 여쭙는다면, 말씀하신 것 중에 '대부분의 Cre mouse'가 TG mouse라고 하셨는데요,
1) 그렇다면 TG mouse 가 아닌 Cre mouse도 가능한지요?? '모든' Cre mouse가 Cre를 발현하도록 만든 TG mouse라고 생각했는데, 어떻게 TG 가 아니면서 Cre mouse 가 가능한지 궁금합니다..
2) 또 TG mouse 가 아닌 Cre mouse의 경우 Cre recombinase 의 toxicity 걱정이 없는 것인지요?

처음 질문과는 좀 방향이 다른 질문입니다만, 관련된 내용의 개념을 처음 잡다보니 궁금한 것이 많네요 ^^ 설명해 주시면 정말 감사하겠습니다..

Cre (비회원)
2009.09.10 01:17

Transgenic mouse 와 gene targeted mouse 의 차이는 아래 다른 질문에 답한 내용을 참고하시기 바랍니다. 즉, Cre mouse 는 특정 genomic locus 에 gene targeting 방법으로 만들 수도 있는데 들어가게 되는 곳의 유전자 promoter/enhancer strength 에 따라 발현정도가 약할 수도 있고 강할 수도 있습니다. 그러나 특정 유전자의 발현패턴을 그대로 따라갈 수 있다는 장점이 있으며 single copy 로 발현되기 때문에 toxicity 문제는 없는 경우가 많습니다. 결국 Cre line 을 만들면 만드는 사람이나 쓰는 사람이나 사전에 잘 characterize 해야 실험용으로 나온 결과는 제대로 해석할 수 있겠지요. 좋은 연구 하세요.

초보자 (비회원)
2009.09.11 06:33

아, 정말 감사합니다. 많은 도움이 되었습니다. 공부할 게 정말 많네요..

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