갖고 계신 TA vector를 이용한 실험에서 Blue colony중 한두개를 얻어 Plasmid를 뽑은 후 EcoRV를 사용하여 잘리는지를 먼저 확인해 보세요.
EcoRV에 의해 잘린다면 이는 T가 없는 EcoRV의 self ligate입니다. 이를 확인했으면 대량으로 키운 후 충분한 양의 plasmid를 얻고 이를 EcoRV로 많이 잘라 놓으세요.
(부연하여 말씀드리면 해당 TA vector는 EcoRV로 자른 blunt end에 Taq이나 또는 terminal transferase를 이용해 3'말단에 T를 붙인 것입니다. 따라서 blue colony는 원래의 lacz coding frame이 맞을 수밖에 없기 때문에 blue가 뜨고 EcoRV에 의해 잘릴 수 밖에 없습니다).
EcoRV로 자른 DNA에 Taq pol (A tailng기능이 있는)과 dTTP만을 넣고 72C 에서 1시간 정도 반응한 후 정제해서 사용하면 이것이 TA vector입니다.
Option이긴 하지만 가능한 self를 줄이기 위해 EcoRV를 처리한 DNA에 CIAP를 처리해주는 것도 좋습니다. (자세한 것은 인터넷에서도 쉽게 찾을 수 있을 겁니다).
위와같이 했을때 최소한 구입한 것 정도의 효율로 많은 양의 TA vector를 만들순 있지만.... 글쎄요, 저는 왜 TA vector를 많이들 사용하는지 잘 이해를 못해서.....
그리고 terminal transferase를 이용하거나 또는 3'T overhang을 만드는 XcmI이나 AhdI과 같은 restriction enzyme을 사용하는 방법도 있으며 이보다 백배는 효율이 더 좋은 Topoisomerase를 이용하는 방법도 조금만 자료를 찾아보면 그리 어렵지 않습니다. 20-50회에 수십만원하는 제품을 구입해 사용하는 것보다 조금마한 노력으로 자손만대까지 쓸수 있는 양을 그리 어렵지 않게 만들 수 있습니다.
