IP background가 심해요

답답이 (비회원)

등록일 2008.10.07 22:22:10
조회2174

IP를 하는데 negative의 background가 심해요
lane에서 그 밑 부분은 깨끗하지만
103과 80kD 사이에 검게 잡히는게 있어요 ㅠ.ㅠ
wash는 RIPA buffer로 하고 있고 10분씩 rotator에서 돌리고 
세번 반복하고 있습니다
세번이나 반복 실험을 했는데 자꾸 그렇게 나오네요 ㅠ.ㅠ
피눈물같은 샘플들 ㅠ.ㅠ
어떻게 해야 그런 background를 줄일 수 있을지 방법을 알려주세요

#IP background

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답변 1

답변등록

jungeun Yu (비회원)
2008.10.10 18:16

제가 볼 때는 wash 조건을  잡으셔야 할 것 같습니다.

보통 IP wash를 할 때 bead를 포함하여 상등액 100ul남기고 buffer 1ml 첨가하시죠?

10min씩 rotator 돌릴 것 없이 부드럽게 inverting만 하셔도 충분할 듯 합니다.

여기서 정량적인 생각이 좀 필요한데요.

상등액 100ul에 buffer 1ml을 첨가하신다는 것은 bead에 붙지 못한 상등액에 남아 있는 protein이 1/10로 dilution이 된다는 개념이잖아요?

만약 protein이 굉장히 overexpression 되어 1/10씩 3번 dilution해도 antibody에 잡힐 정도로 남아있다면,  background는 계속 잡힐 것 아닙니까?^-^;

wash를 5~6번 정도로 더 늘려 보시고, 상등액을 50ul정도로 줄여보시는 것도 효율적인듯 합니다. 

새로운 마음으로 buffer도 새로 만들어 보심이 어떨지요.^-^

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