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westernblot 할때 Ab로 단백질 detection 이해가 안되요..ㅠㅠ

레벨1 초짜석사 ()

등록일 2008.02.27 17:09:08
조회3614

안녕하세요~ 
석사생활 시작한지 2달 되는 초짜대학원생입니다..ㅠㅠ

저희 실험실에서는 cell 에 GFP를 transfection 시켜서 IP 를 하고 western 을
하는데요. IP 에서 GFP Ab 쳐서 bead 붙여서 가라앉히는 것은 이해를 하겠는데..
western 시에 붙이는 Ab가 이해불능입니다.

Ab sumo로 쳐서 GFP 와 sumo가 binding 하는 지를 알아본다고 하는데..
그렇다면 단백질들이 쭉~다 연결이 되어있는 건지.. 왜 GFP를 잡아냈는데 
다른 단백질이 연결되있는지 보는 건지 아직 체계가 잡혀지지 않습니다..

말이 횡설수설 하였는데요..ㅠㅠ 고수님들의 답변 부탁드립니다..ㅠㅠ

#westernblot
#Ab

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답변 4

답변등록

레벨8 엘피스
2008.02.27 17:24

GFP와 SUMO의 관계가 아니라 GFP에 붙어 있는 어떤 단백질과 SUMO의 관계일 겁니다.

이를 가령 A라 했을때 GFP-A가 SUMO와 결합을 한다면 세포내에서 GFP-A/SUMO는 complex를 이룰 것이고 여기에 GFP antibody를 사용하면 GFP-A/SUMO complex를 회수할 수 있게 되는데 실제로 이 comlpex를 SDS-PAGE한 후 SUMO antibody로 처리해 보면 SUMO가 관찰될 겁니다. 반대로 만약 SUMO antibody로 western결과가 나오지 않으면 GFP-A와 SUMO는 결합을 하지 않는 것이 되겠죠.

이를 co-immunoprecipitation analysis라고 합니다.

단백질들은 여러가지 방법으로 상호 interaction을 하며 결합을 합니다. 쭉 연결되어 있는 것이 아니라 여러가지 방법으로 붙어 있는 것 (아직도 인간이 다 풀지못하고 있는 아주 복잡한 구조) 입니다.

초짜석사 (비회원)
2008.02.27 17:29

우와~
너무너무너무너무너무 감사합니다 ^^*
co-immunoprecipitation analysis 에 대해서 더 공부해봐야겠어요~ ㅎㅎ

감사합니당~~ ♡

SJK (비회원)
2008.02.28 13:53

위에 엘피스님의 말씀도 일반적인 경우로 보면 맞습니다.
하지만 SUMO의 경우 유비퀴틴처럼 세포내에서 특정 프로테인에
covalent하게 연결되기도 하는 small protein modifier이기 
때문에 위와 같은 interaction의 경우만이 아니고 GFP와 
연결되어 있는 protein이 sumoylation의 타겟일 가능성도 있을
것입니다. 
둘중 어느 경우인지는 직접 교수님이나 가르치는 분께 물어봐야
할 것입니다.

초짜석사 (비회원)
2008.02.28 17:26

아.. 그렇군요..

알겠습니다.. 감사드립니다^^ 

너무너무 어렵네요..ㅠㅠㅋ

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