실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
급질문.. inclusion body와 western blot
모모엄마.. (비회원)
- 등록일 2007.05.12 00:49:40
- 조회8140
현재 2개 단백질을 재조합해서 만들었습니다. 그런데 둘다 inclusion body로 나온다고 생각이 듭니다. 정제하기 전에 tris, triton x-100, EDTA가 들어 있는 buffer에서 sonication 후 원심분리 해서 sup만 SDS-PAGE를 하고 western으로 확인했습니다. western에서는 band를 봤구요.. inclusion body로 가는 protein도 위에서 설명한 buffer만 쓰고, sonication 해서 lysis한 다음 western하면 쉽게 밴드를 볼 수 있나요? 어떤 분은 inclusion body로 가면 western 해도 밴드 안나온다고 하던데요.. solubility test할 때는 처음에 lysis할 때 triton x-100 같은 detegent 안 쓰고 그냥 PBS에 cell suspension해서 sonication 하고 원심분리 해서 나온 pellet 을 8M urea로 녹여서 SDS-PAGE하고 coomassie staining 해서 밴드를 봤는데, sup에선 induction된 원하는 band가 안나오더라구요... 8M UREA로 녹인 pellet에서만 왕창 나왔어요... 그래서 다른 분의 solubility protocol로 다시 실험을 했는데요. (위에서는 인덕션 온도를 바꾸지 않았거든요..) 37(3시간), 30(5시간), 20도(O/N)에서 induction시키고(IPTG는 OD600=0.6일 때 0.4 mM로 동일하게 넣어 주었습니다.) 원심 분리해서 pellet 무게 0.3g당 5ml의 20 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% sucrose 조성의 buffer로 녹인 후 30분간 4도에서 rotation 시키고 sonication 없이 200 ul만 e-tube에 넣고 바로 원심분리 1시간 해서 나온 sup과 pellet을 SDS-PAGE해 보니 pellet은 엄청 진하고, sup을 loading한 lane은 다른 단백질 밴드도 잘 안보입니다.. (이 단백질이 사이즈도 10 kd 이라 15 % gel에서도 거의 맨 밑에 걸리는 문제도 있습니다.) 일단 30도에서 induction이 잘 되는 것 같지만, 이 역시 pellet lane의 밴드라서.. 이런 경우 sup lane의 다른 기타 밴드들도 잘 안보이는 것으로 봐서 cell lysis 자체가 잘 안된것이라고 판단해도 되나요??? sonication을 해 볼 걸 하는 후회가 마구드네요.. 급하게 정제해야 하는데 (한달안에 정제해서 activity test해야 하거든요..ㅠ,,ㅠ 과제 결과 보고서가 급한 상황이라..) refolding 하는건 조건 잡는 것도 힘들 것 같고 어떻게 해야할지 막막하네요... 말로만 설명하다 보니 좀 장황해졌는데요.. 고수님들의 답변 또는 의견 부탁 드립니다.
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