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westernblot 결과 문제

레벨1 레몬트리 ()

등록일 2007.03.10 10:05:16
조회4493

westernblot에 대해 궁금한 점이 있어 질문올립니다..

1. transfer한 후 ponceau로 membrane을 염색해서 band를 확인하는데...

   band가 뚜렷이 보이지 않고 band사이에 하얗게 세로줄이 있어요~~
  
   무슨 불순물이 끌고 내려온 것 처럼 하&#50576;게 끊겨있네요...이건 loding할때

   불순물이 들어가서 단백질이 고르게 내려오지 못해서 생기는 건가요...

   제 단백질은 rat liver tissue에서 50-100mg을 떼어내어 sonicator사용한 것

   이예요...

2. 2nd Ab를 붙인후, TBST로 washing한 후에...membrane을 casette위에 올려서

   1.5ml tube에 1:1로 섞어둔 ECL을 membrane위에 뿌려준 후,

   화일 속지를 얹고 기포 빼주고, 현상을 하는데요...

   현상결과,,,membrane주변에 ECL이 매우 지저분하게 나와있어요..ㅠㅜ

   이 현상이 생겼다 안생겼다 하는데...모가 문제여서 그런건가요...

   똑같이 하는데 어떤때는 transfer와 현상이 잘나오고 어떤때는 안나와요..

   제발 알려주세요~~

#westernblot

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답변 5

답변등록

ahbdh (비회원)
2007.03.10 11:08

band 사이에 하얗게 줄이 생기는건 단백질이 고르게 내려오지 않은게 아니라 transfer할때 문제가 있어서 나타난 것으로 생각됩니다. 그리고 ECL이 지저분하게 나올때도 있고 안나올때도 있는건 저같은경우엔 필름의 문제에 그런경우가 생겼습니다.
필름이 좀 오래된걸 사용하니 어떤건 깨끗하게 나오지만 어떤건 지저분하게 나오네요.
필름을 새걸로 사서 하니 그런문제는 없어졌습니다.
또 다르게 생각해보면 ECL넣고 나중에 제거할때 어떻게 제거하시는지요...
거기에서 ECL이 남아있어도 그런현상이 나타납니다.
저같은경우는 킴와이퍼스로 ECL을 딱아내는 수준은 아니고 살짝 빨아들입니다.
그후 ohp필름을 덮어 현상합니다.

레몬트리 (비회원)
2007.03.10 11:14

ECL을 membrane위에 약ml 뿌려준후, OHP필름이나 화일 속지로 덮은 다음

킴와이프로 문질러서 기포를 빼줍니다..

보통 memb에 ECL을 뿌리고 몇분정도 반응시키나요? 

하얀 줄은..transfer할때 이상이었구나...buffer부터 바꾸고 다시 해봐야 겠습니다..^^

ahbdh (비회원)
2007.03.10 11:16

ECL을 그렇게 오랫동안 반응시킬 필요는 없습니다.

저같은 경우는 한번 담궈주고 바로 빼서 사용합니다.

blocking (비회원)
2007.03.11 07:49

blocking을 잘해보세요.

레벨5 허접 대학원생
2007.03.12 11:40

transfer중에 membrene사이에 이물질이 껴들어가거나 기포가 있으면 그렇게 나올 수 있구요. ECL시에는 용액을 어느정도 제거해주시는게 좋을듯 싶네요. 저도 킴와이프스에 membrane을 가로 데어서 용액을 어느 정도 제거한후에 속지에 넣어주거든요.

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