클로닝에 관한질문입니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q 클로닝에 관한질문입니다.

크로닝하수(비회원)

05.06.22 00:00
조회4065

 플라스미드를 두개의 다른 엔자임으로 자른후 필요한 부분을 젤 익스트렉션하고 링커를 이용하여  라이게이션을 한후 칼슘클로라이드를 사용하여 트랜스포메이션을 하는 실험을 하고있는데 결과가 안나옴니다. 
매 단계 마다 전기영동을 통해 확인을 하고있는데 제가 볼때는 라이게이션 단계에서 문제가 있는것 같아요.
라이게이션을 하면 디엔에이끼리의 셀프 라이게이션때문에 여러개의 밴드가 나오는 걸로 알고있는데 그런게 전혀안나오고 원밴드만 나옴니다. 컨트롤로 링커를 넣지 않은 걸 사용하기는하는데 링커의 사이즈가 작기때문에 라이게이션 된것과 아닌것을 구분하기는 힘든 상황입니다. 
어떻게 해야할까요 티포 라이게이즈가 이상한걸까요? - 절박함니다....ㅜㅡ

#cloning

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A 답변 4

레벨01 엘알에스랩 (비회원)
05.06.22 00:00

 안녕하십니까 엘알에스랩입니다

plasmid를 두개의 다른 enzyme으로 cutting하셨다면, self ligation 은 일어나지 않습니다. 같은 enzyme으로 처리 했을때와 blunt end일 경우에만 self ligation 이 일어납니다. one band만 나오는것이 당연한것 같습니다. (ligation 후 하나의 enzyme으로 cutting하셨다는 가정하에서 입니다.)

그리고 귀하의 설명이 좀 부족한듯 합니다. plasmid에 다른 fragment를 삽입하셨다는 이야기 인지, 아니면 plasmid를 두개의 enzyme으로 cutting후 self ligation을 하셨다는 이야기인지 이해하기 어렵습니다.

건승하시기 바랍니다.

답변리플

레벨01 엘피스 (비회원)
05.06.22 00:00

 원밴드라뇨??????

Linker의 크기가 작다 뿐이지 분명히 double RE/ligation인데?????
하나의 enzyme으로 self ligation을 하더라고 major는 원밴드이겠지만 intermolecular ligation에 의한 multimer가 형성이 됩니다.

이경우에 있어서도 multimer가 나오는 것이 정상입니다. Ligase의 활성을 테스트해보세요. 아주 간단한 것이 하나의 enzyme으로 자른 two cut이나 three cut DNA를 (람다 HindIII를 쓰는게 가장 좋지만) 상온에서 10분간만 ligation하여 전기영동했을때 multiband 또는 위로 shift된 band가 보이지 않으면 ligase활성이 없는 것입니다.

답변리플

레벨01 크로닝하수 (비회원)
05.06.22 00:00

 우선 답변 감사드리구요.. 원밴드가 나오는게 맞는 거라니 더욱난감해지네요ㅋ
플라스미드에다른것을 삽입하는게 아니구 딜리션 후 잘라진 두놈중에 한놈만을을 젤익스트렉션한후 링커를넣고 함께 라이게이션 하는 실험입니다.
그렇다면 어디가 잘못 된건지...

답변리플

레벨01 나그네.. (비회원)
05.06.22 00:00

 MCS 부분의 enzyme site를 자르면 원밴드겠지요..
주로 construct 만드시는 분들이 MCS을 먼저 생각하니깐요..
질문하신 분의 경우는 두 조각 중에 vector로 쓰이는 부분만 사용하시는 것 같습니다.
두밴드가 나와야 하는 경우가 맞는거 같네요..

저같은 경우는 ligation이 안될 시에는..
1. buffer와 D.W
2. DNA
3. T4 DNA ligase를 확인합니다.

buffer가 활성이 떨어지는 경우가 있습니다. 계속 사용하시다 보면요..
fresh한 buffer가 있으시면 이용해보시는 게 좋을 것 같네요.