실험 Q&A Plant Biology > Transformation
E.coli에서 protein overexpression 과 purification의 문제
Ju (비회원)
목적하는 Arabidopsis의 gene을 pET-15b에 cloning 한 후에 BL21(DE3)에서 발현을 시켰습니다. His-Tag 과 specific Ab를 이용하여 Wetern blot으로 발현유무도 확인했습니다. 여기까지는 문제가 없었는데... 문제는 이 gene의 overexpression level이 낮고, Ni-NTA column(novagen)을 이용하여 정제를 하면 원하는 band 이외에 다른 band가 너무 많이 잡힌다는거죠. overexpression 조건을 잡기 위해서 온도, IPTG농도, Induction time 등을 달리하여 가장 발현이 잘 되는 조건을 잡긴 했으나... 그 역시 발현율이 높다고는 말하기 힘들구요, 정제 후에도 목적 단백질 이외에 다른 단백질이 너무 많이 존재해서 문제가 됩니다. 정제시 wash buffer의 imidazol 농도도 조절해보고, resin과 binding 시간 등도 변화를 줘봤으나 별다른 차이는 없습니다. 그리고 발현시킨 단백질 중의 하나는 Antibody를 만들 목적으로 하고 있기 때문에 더 답답합니다. Host strain을 바꾸어서 BL21(DE3)pLysS에서 발현도 시켜봤지만, 여기서는 거의 발현이 안되더라구요. Novagen의 autoinduction system을 이용해서 발현도 시켜봤으나 별차이가 없었구요. E.coli와 Arabidopsis의 codon usage가 다른 문제와, pET-15b vecter의 His-Tag을 이용한 정제가 깨끗하지 않을 것이라는 예상은 했지만, 다른 host system이나 vecter system을 바꾸기가 쉽지 않은 상태라 여기에서 최상의 조건을 잡아보려고 하고 있는데 계속 결과가 나오기 않아서 조언을 구합니다. 몇달째 별다른 진전이 없는 것 같아서 너무 답답합니다. 좋은 답변 부탁드립니다.