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E.coli에서 protein overexpression 과 purification의 문제

Ju (비회원)

등록일 2006.11.03 08:48:51
조회6431

목적하는 Arabidopsis의 gene을 pET-15b에 cloning 한 후에 BL21(DE3)에서 발현을 시켰습니다. His-Tag 과 specific Ab를 이용하여 Wetern blot으로 발현유무도 확인했습니다. 여기까지는 문제가 없었는데... 문제는 이 gene의 overexpression level이 낮고, Ni-NTA column(novagen)을 이용하여 정제를 하면 원하는 band 이외에 다른 band가 너무 많이 잡힌다는거죠. overexpression 조건을 잡기 위해서 온도, IPTG농도, Induction time 등을 달리하여 가장 발현이 잘 되는 조건을 잡긴 했으나... 그 역시 발현율이 높다고는 말하기 힘들구요, 정제 후에도 목적 단백질 이외에 다른 단백질이 너무 많이 존재해서 문제가 됩니다. 정제시 wash buffer의 imidazol 농도도 조절해보고, resin과 binding 시간 등도 변화를 줘봤으나 별다른 차이는 없습니다. 그리고 발현시킨 단백질 중의 하나는 Antibody를 만들 목적으로 하고 있기 때문에 더 답답합니다. Host strain을 바꾸어서 BL21(DE3)pLysS에서 발현도 시켜봤지만, 여기서는 거의 발현이 안되더라구요. Novagen의 autoinduction system을 이용해서 발현도 시켜봤으나 별차이가 없었구요.

E.coli와 Arabidopsis의 codon usage가 다른 문제와, pET-15b vecter의 His-Tag을 이용한 정제가 깨끗하지 않을 것이라는 예상은 했지만, 다른 host system이나 vecter system을 바꾸기가 쉽지 않은 상태라 여기에서 최상의 조건을 잡아보려고 하고 있는데 계속 결과가 나오기 않아서 조언을 구합니다. 몇달째 별다른 진전이 없는 것 같아서 너무 답답합니다. 좋은 답변 부탁드립니다.

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답변 4

답변등록

음... (비회원)
2006.11.03 10:45

저도 똑같은 일 때문에 고생한게 생각납니다. 

저는 님께서 해결책으로 해보신 정제시 wash buffer의 imidazol 농도의 변화를 통해 조건을 잡아서 해결을 보았습니다. 

그리고 저역시 과발현이 목적이었는데 이놈의 것은 SD와 ATG의 거리부터 시작해서 별별짓을 해도 많이 발현을 안하더라고요...그래서 결국은 왕창 정제한 후에 농축을 했습니다. 

행운을 빕니다. 정제라는게 정말 쉬운것이 아닙니다. affinity를 이용한 정제에서 비일비제하게 일어나는 일입니다. 하나하나 조건을 잡아 보세요.

Mad Scientist (비회원)
2006.11.03 12:14

1. Codon Usage를 체크해 보세요. (Google 등에서 검색해 보면 amino acid sequence를 붙여넣으면 codon usage를 체크해 주는 툴들을 찾을 수 있습니다) 만약 E.coli에서 극히 적은 빈도로 사용되는 AGA/AGA (Arginine), AUA(isoleucine), CUA (leucine) 등과 같은  Codon이 많이 존재한다면 해당하는 rare codon에 해당하는 tRNA 유전자가 별도의 plasmid에서 발현되는 BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (Stratagene) 이나 Rosetta (DE3) (Novagene) 과 같은 E.coli strain에서 발현하면 발현양이 증가할 ''수도'' 있습니다. 

2. 사실 Ni-NTA의 경우에는 발현양이 약할 경우 잡다한 것들이 원래 많이 붙습니다. 이런 경우에 Washing 시의 Imidazole 농도를 높이거나 Step Gradient (20mM Imidazole, 50mM, 100mM 이런식으로) 을 주어서 Fraction을 받는다든지, 아니면 Gradient Mixer 등을 이용하여 Imidazole Gradient 를 준다든지 여러가지 방법이 있습니다만, 그래도 Ni-NTA 만으로 발현양이 낮을때 Purity를 높이는데는 한계가 있습니다. 

3. 이 경우에는 Culture volume 을 늘리고, Ni-NTA 를 거친 후 다른 Chromatography (ion-exchange, gel filtration 등) 를  하는 것 이외에 확실한 방법은 없습니다. Protein Works을 많이 하는 실험실이 있다면 이 정도의 기본적인 컬럼웍은 할 수 있겠지요.

레벨6 juno
2006.11.03 12:51

저도 codon usage의 문제가 아닐까 하는 생각이 듭니다.
이런 경우 유전자를 E. coli에서 많이 존재하는 codon으로 다 뜯어 고치거나 host를 바꾸는 것이 해결책이 될텐데 codon을 일일이 뜯어 고치는 것도 쉽지 않고 다른 host system을 구축하기도 쉽지 않으신 상황인 것 같군요.

혹은 E. coli의 rare codon 문제를 해결하기 위한 strain도 있으니 그걸 한번 사용하시던지요. 

일단 codon usage를 check하시고 정말 그것이 문제라면 system을 바꾸시는것이 방법입니다.
현재의 system으로 계속 하시는 것 보다는요.

inno12-001.pdf

Ju (비회원)
2006.11.07 06:05

우선 답변에 너무 감사드리구요. Juno님의 첨부파일이 열리지 않는데, 무슨 내용인지 알 수 있을까요? 아니면 메일로 보내주실 수 있으신지요? 메일 주소는 crom0242@naver.com 입니다. 감사합니다.

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