안녕하세요.
pET28b(+)에 msfGFP–EAAAK linker–CBD7 construct를 cloning하고 있는데 약 6개월째 같은 단계에서 계속 실패하고 있어 조언을 구하고자 글을 올립니다.

NdeI – msfGFP – EAAAK×4 linker – CBD7 – stop – XhoI 이 최종 construct이고, 예상 크기는 약 1,257 bp입니다.

처음부터 현재까지의 상황을 최대한 자세히 적어보겠습니다.

1. 기본 cloning 방법
먼저 msfGFP와 CBD7을 각각 PCR로 증폭한 후, 두 fragment 사이에 EAAAK linker가 overlap되도록 primer를 설계했습니다.
각 fragment의 PCR product 크기는 대략
* CBD7: 537 bp
* GFP: 780 bp
정도이며, primer 없이 Step 1 overlap PCR을 진행하고, 이후 외부 primer를 이용하여 Step 2 PCR로 최종 약 1.25 kb fusion product를 증폭하고 있습니다.
Polymerase는 NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase를 사용하고 있습니다.
최근 Step 1에서는 CBD와 GFP를 각각 0.1 pmol씩 넣었으며, Step 1 product 농도는 약 17 ng/µL 정도 확보되었습니다.

2. linker 서열도 한 번 변경했습니다
처음 사용했던 linker는 단백질 수준에서는 EAAAK×4이고, DNA 수준에서는 동일한 서열이 거의 반복되는 형태였습니다.
즉 linker 부분에 GAAGCTGCGGCAAAA 계열의 반복이 여러 번 존재했습니다.
반복서열 때문에 overlap PCR이나 downstream cloning에 영향을 줄 가능성을 생각하여, 이후에는 아미노산 서열 EAAAK×4는 유지하면서 codon을 바꾼 linker로 변경했습니다. 그런데 linker를 변경한 이후에도 최종 cloning 실패 현상은 계속되고 있습니다.

3. Step 2 PCR에서 비특이 밴드가 계속 발생합니다
원래 NdeI/XhoI용 외부 primer는 다음과 같습니다.
F-GFP-NdeI: AACATATGTCTAAAGGTGAAGAACTGTTC
R-CBD7-XhoI: TTTCTCGAGCTAAATCTTTTTAACAAACTT

전체 primer sequence를 기준으로 Tm을 계산하면 비교적 높게 나오지만, 실제 template에 annealing하는 부분만 NEB Tm Calculator에 넣었을 때는 두 primer의 Tm 차이가 상당히 컸습니다.

* NdeI forward 실제 annealing 부분: 약 55℃
* XhoI reverse 실제 annealing 부분: 약 47℃
정도로 나왔고, primer pair 기준 권장 annealing temperature는 약 51℃ 정도였습니다.

예전에는 전체 primer를 기준으로 60℃ 이상에서 PCR을 진행한 적도 있고, 최근에는 실제 annealing 부분을 기준으로 50–52℃, 또는 51–52℃에서 Step 2를 다시 진행했습니다.

문제는 어느 조건에서도 예상 크기인 약 1.25 kb 부근의 band는 나오지만 다른 크기의 band들도 계속 함께 발생한다는 점입니다.
과거에는 약 1.4 kb 부근 band가 매우 강하게 나타나는 경우도 있었으며, target 부근 여러 band가 같이 나온 적도 많았습니다.
그래도 target 위치로 판단되는 band를 잘라 gel extraction 후 restriction digestion을 진행했습니다.

4. 중간에 NdeI 대신 HindIII도 시도했습니다
NdeI 조건에서 반복적으로 cloning이 실패하여, 한 번은 GFP forward restriction site를 HindIII로 변경했습니다.
그런데 HindIII/XhoI digestion 후에는 target으로 생각되는 band와 함께 400–500 bp 정도의 추가 band가 반복적으로 나타났습니다.
최근 전체 insert sequence를 다시 확인해보니 CBD7 내부에 HindIII recognition site인 AAGCTT가 이미 존재하고 있었습니다.
따라서 HindIII를 사용하면 insert 내부가 잘리는 문제라는 것을 뒤늦게 확인했고, HindIII는 포기하고 다시 NdeI/XhoI로 돌아왔습니다.

5. NdeI/XhoI로 다시 cloning했지만 colony PCR에서 또 동일한 결과가 나왔습니다
최근 다시 NdeI/XhoI로 Step 2 PCR → gel extraction → double digestion → cleanup 후 ligation을 진행했습니다.

Ligation은
* Vector : Insert = 1:3
* Vector : Insert = 1:5
두 조건으로 진행했고, transformation할 때 ligation mixture 양도 각각 5 µL / 10 µL로 나누어 총 4조건을 확인했습니다.
그런데 colony PCR 결과가 또 이전과 동일했습니다.
약 300 bp 부근의 band만 반복적으로 나옵니다.

과거에도 T7 promoter / T7 terminator primer를 이용한 colony PCR에서 계속 300–400 bp 정도의 band가 나타났고, 정상적인 insert가 들어갔다면 기대하는 약 1.3 kb 이상의 band가 거의 나오지 않았습니다.

과거 몇 차례 colony를 골라 plasmid extraction과 sequencing까지 진행한 적도 있지만, sequencing에서 promoter/terminator 부근만 확인되고 최종 insert 전체가 정상적으로 들어갔다고 확인하지 못했습니다.
즉 결과적으로 empty vector 또는 정상 insert가 없는 colony를 계속 얻고 있는 것으로 생각하고 있습니다.

6. 이상한 점은 같은 실험실의 다른 construct들은 cloning이 잘 됩니다
같은 vector, 유사한 protocol을 이용하는 다른 phage/CBD construct들은 cloning이 성공한 사례가 있습니다.
LM10 역시 저와 동일하게 XhoI site 앞에 TTTCTCGAG 구조를 가지고 있습니다.
따라서 처음에는 제 XhoI primer의 restriction site 앞에 3 nt밖에 없는 것이 문제인가 생각했지만, LM10도 동일한 TTT-CTCGAG 구조인데 cloning이 성공한 사례가 있어 이것만으로는 설명이 되지 않는 것 같습니다.
다만 차이점은 LM10의 실제 gene-specific annealing 부분은 제 primer보다 상당히 길고, 제 XhoI reverse primer의 실제 annealing 부분은CTAAATCTTTTTAACAAACTT 정도로 짧고 Tm이 낮습니다.

7. 현재 가장 궁금한 점
현재까지 동일한 construct를 여러 번 반복하면서 PCR 조건, linker sequence, restriction enzyme, ligation ratio, transformation 조건 등을 바꿔 보았는데도 계속 실패하고 있어 더 이상 무작정 조건을 바꾸기 어려운 상황입니다.

특히 다음 부분에 대해 조언을 받고 싶습니다.

1. NdeI/XhoI digestion gel에서 약 1.25 kb 크기의 band가 정상적으로 보이는데도 실제로는 insert 말단 digestion이 제대로 되지 않아 ligation이 실패할 가능성이 있을까요?
2. 제 R-XhoI primer의 실제 annealing 부분이 약 21 nt이고 Tm이 약 47℃ 정도인데, 이 primer 자체를 더 길게 재설계하는 것이 가장 우선일까요?
3. Step 2에서 target band는 나오지만 multiple bands가 계속 발생한다면, gel extraction으로 target band를 골라 사용해도 cloning에 문제가 생길 수 있을까요?
4. 같은 pET28b(+), ligase, competent cell 등을 사용한 다른 construct들은 잘 되는데 이 construct만 반복적으로 empty-vector처럼 보이는 colony PCR 결과가 나오는 경우, 어떤 부분을 가장 먼저 의심해야 할까요?
5. vector의 incomplete digestion / self-ligation과 insert digestion 문제를 구분하기 위해 어떤 control을 반드시 같이 진행하는 것이 좋을까요?
6. 현재 NdeI/XhoI 시스템을 유지하면서 문제를 해결할 수 있을지, 아니면 primer를 다시 설계하거나 cloning strategy 자체를 바꾸는 것이 나을지 의견을 듣고 싶습니다.

약 6개월 정도 계속 반복하고 있어 시간과 비용 부담이 큰 상황입니다.
제가 놓치고 있는 부분이 있는지, 비슷한 경험이 있으셨던 분들의 조언을 간곡히 부탁드립니다.

감사합니다.