28S 시퀀싱 관련 질문이요 | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q 28S 시퀀싱 관련 질문이요

레벨04 arimari (일반인)

26.09.02 18:12 (수정)
조회83

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안녕하세요

제가 생물 동정을 위해 28S 시퀀싱을 하고 있는데

어려움이 있어 질문 드려요 (처음해보는 region이라 사전정보가 없습니다.ㅜㅜ)

28S D2-D3를 포함하여 약 800bp ~ 900bp 정도를 PCR 을 하고 direct sequencing으로 분석을 하는데

일부 종, 일부 개체에서 중간에 짧게는 100bp가량 길게는 300bp가량 mixed peak가 뜹니다. (개체마다 부위의 위치도 조금씩 다릅니다.)

물론 한번에 잘 읽히는 개체들도 있습니다.

처음엔 secondary structure 의 영향을 생각하고

문제가 있는 샘플들은 PCR 조건을 다양하게 바꿔도 보고 fragment를 나누어 PCR, SEQ도 해보고 Taq도 바꿔보고 gDNA prep도 다시해봐도 해결이 안됩니다.

그러다 28S heterogeneity에 의한 결과라고 생각이 드는데요 (이 부분도 맞는지 조언 부탁드립니다.)

논문들에서는 cloning으로 해결을 하는 것 같은데

워낙 실험해야하는 개체들이 많아서 cloning으로는 단가 문제가 생길 것 같습니다.

해결 방법이 없을까요?

개체들을 계속 바꿔서 실험해야할까요 ?

조언 부탁드립니다.

Mol. Biol.-DNA > Sequencing

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A 답변 1

레벨05 biotech25 (과기인)
26.09.04 23:27

네, target region의 heterogenity가 문제로 보입니다. 한 개체 안에서도 28S rDNA copy들이 서로 조금씩 다른 Indel을 가질 수 있습니다. Indel이 있는 copy와 없는 copy가 섞여 있으면 sanger sequencing 에서 indel 이후 region에서 전부 mixed peak으로 보입니다.

Cloning 없이 해결하려면, D2-D3 ~900 bp를 한번에 읽기 보다는 변이가 덜한 region만 target으로 읽어보세요. Fragment 나누어 PCR/seq 했을 때 깨끗하게 나온 region이 있을 겁니다. 아니면 pair-end sequencing 후, mixed 구간을 IUPAC code로 처리하여 consensus 서열을 만들어 보세요.