나노포어 관련해서 선생님들의 팁을 듣고 싶습니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q 나노포어 관련해서 선생님들의 팁을 듣고 싶습니다.

레벨01 ACTZ (대학원생)

26.09.01 10:51
조회447

이번에 저희 실험실에 나노포어 MinION Mk1D 장비가 새로 들어와서, Native Barcoding Kit 24 (SQK-NBD114.24)를 이용해 Lab protocol optimization을 진행하고 있습니다.

장비 도입 후 트레이닝을 받으며 시험 삼아 런을 몇 번 돌려보았는데, 생각했던 것보다 High yield(Total sequence output)가 잘 나오지 않아서 고민입니다. 아무래도 제 핸들링 숙련도 부족이나 Protocol 상의 미세한 오차가 원인이지 않을까 싶습니다.

나노포어 시퀀싱을 자주 활용하시는 연구자분들의 실전 팁이나 노하우를 공유받고 싶어 글을 남깁니다.

특히 아래 항목들에 대해 조언해 주시면 정말 큰 도움이 될 것 같습니다.

gDNA 추출 및 Quality Control
- High Molecular Weight(HMW) gDNA를 손상 없이 추출할 때 추천하시는 Kit나 Bead 비중, 혹은 팁이 있으신가요? (Vortexing 자제, Pipetting 시 Wide-bore tip 사용 등 외에 추가적인 팁)
End-prep / Native Barcoding Ligation 단계
- Ligation 효율을 극대화하기 위해 반응 시간이나 온도 condition을 변경하신 경험이 있으신가요?
- Barcode ligation 이후 Cleanup 단계에서 Short fragment 제거 및 recovery 효율을 높이는 나름의 노하우가 궁금합니다.
Flow Cell Loading 및 Handling
- Flow Cell Priming 및 Sample loading 시 Bubble 발생을 완전히 차단하는 자신만의 핸들링 팁이 있으신지 궁금합니다.
- Membrane 손상을 줄이기 위해 주의해서 다루시는 부분이 있다면 조언 부탁드립니다.

아주 사소한 팁이나 "이 단계에서는 이걸 꼭 주의해야 한다" 하는 경험담도 저에게는 정말 귀한 자료가 됩니다.

바쁘시겠지만 지나치시지 않고 한 마디씩 남겨주시면 감사히 배우겠습니다.

긴 글 읽어주셔서 감사합니다!

Mol. Biol.-DNA > Sequencing

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A 답변 4

레벨01 박경민0933 (과기인)
26.09.01 18:25

안녕하세요. 우선적으로 시퀀싱 퀄리티가 낮다라는 것은 라이브러리 준비단계에서 본인의 라이브러리 퀄리티를 먼저 점검하시면 좋습니다. 나노포어가 롱 리드 타겟이고 길이가 긴 DNA들이 많고 양이 많으수록 (일루미나랑 다르게 일정 양에서 amplication하면서 시퀀싱이 아니라 mechanical 시퀀싱 방식이다보니 처음 라이브러리 샘플 농도와 퀄리티가 굉장히 중요합니다. 예를 들어, 일반적인 cell에서 뽑은 핵산과 sup이나 serum에서 뽑은 핵산의 양과 질에서 차이가 많이 납니다. 나노포어는 짧거나 제대로 프랩이 안되었거나 불순물 등이 섞여 잇으면 fail read가 많이 생깁니다. 나머지는 프로토콜 잘 따라거거나 필요한 경우 줄이는 것도 고려됩니다.(저흰 library enrichment하여 생성되는 데이터가 많아지다 보니 포어 수가 금방 소모되어, 예상하는 만큼의 시퀀싱 데이터만 얻고 플로우 셀 재사용 비율을 높이기 위해 시약을 절반 줄여서 사용합니다)

답변리플

레벨01 YOLO (과기인)
26.09.02 11:04 (수정)

답변을 읽다 궁금한 점이 있어 질문 드립니다.

1. Library Enrichment 하여 생성되는 데이터~
이는 Adaptive sampling을 이야기하시는 것인지요? 아니면 자체적으로 Amplicon 등을 만드셨다는 것일까요?

2. 시약을 절반 줄여서 사용합니다
시약을 절반 줄여서 사용한다는 것은 어느 단계에서 줄이는 것인지요? Nanopore Ligation Sequencing Kit 를 말씀하시는 것이라면 library 제작에 필요한 최소 DNA 분자 수나 시약 양 등이 있을텐데 어떤 식으로 줄여서 쓰시는지 궁금합니다.

레벨01 박경민0933 (과기인)
26.09.02 16:32

1. 단순하게는 PCR로 DNA enrichment하는 방향(amplicon)이 있을 수 있고, 이외에도 여러 방법으로 library를 +/- enrichment할 수 있습니다(SISPA, RNA access 방법 등 다양)

2.저희의 경우 미생물 타겟으로 시퀀싱하는데, 특정 부위나 WGS이 필요한 경우, 라이브러리를 enrichment하게 되면 DNA 양이 과다해져 그 양을 큐빗으로 계산한뒤 맞춰서 시약을 줄입니다.(결국 사용되는 시약이란게, 그 키트에 몇 회 사용에 의존적인 건데, 시약 양을 얻을려고 기대되는 시퀀싱 raw data 양에 비례하게 맞추어 설정합니다. 예를 들어, 라이브러리 양이 퀄리티 낮고 적은데 꼭 raw data를 많이 얻어야할 경우, 그냥 시약 원래 비율대로 사용하고, 아주 좋은 라이브러리 적은 양의 outuput을 얻으려는 경우(목적성을 가지고 일정시간만 시퀀싱이 필요한경우), 양을 줄여서 사용합니다.. 두서없이 설명하긴 했네요. 제일 좋은 것은 본인이 하려는 실험 목적과 방법에 적합한 방식 지금 보니 여러 개 샘플을 barcoding해서 하시는 것 같은데.. 라이브러리 체크, 바코딩별 샘플 비율도 잘 봐야겠지요. 바코더가 제대로 안붙었으면 unclassfied로 가는 데이터가 많아서 퀄리티가 안 좋다고 하시는것인지. 결과 레포트를 보기 전까진 확답할 수 없습니다. 결과 레포트를 보시고, 잘 모르시는 경우, 구매한 회사에 학술팀있으니 문의하는 것도 도움됩니다. 저희도 처음 세팅할때는 그렇게 도움받고 그다음 랩에 맞게 modify했습니다.

레벨01 YOLO (과기인)
26.09.02 13:31

나노포어 커뮤니티 계정을 가지고 계시다면 공식 자료가 도움이 될 것으로 생각합니다(Sequencing resources | Oxford Nanopore Technologies).

사실 gDNA-QC 부분은 위의 답변처럼 샘플 상태에 따라 결정되는 것들이 너무나 많아서 샘플이 어떤 것인지에 대한 정보가 필요합니다.

샘플 별로 기본적인 gDNA 추출 권장 사항이나 QC에 대한 정보는 커뮤니티에 잘 나와있으니 보시면 도움이 될 것 같습니다.

Yield 측면에서는 가장 좋은 방법은 많은 양의 input을 넣는 것이지만 그것은 어려우실 것 같고 경험적으로는 bead 결합 시간을 조금 늘리면(약 1.5 - 2배 정도) recovery 효율이 증가했습니다.

Short fragment 의 제거는 젤을 내리거나, bluepippin등을 사용하는 방법이 있을 것 같고 bead volume을 조정하여 사이즈를 일부 조정하는 것도 가능합니다. 물론 위 방법들은 recovery 효율 측면에서는 권장하지 않습니다. Long-read 를 생산하는 가장 좋은 방법은 초기부터 HMW DNA를 추출하는 것으로 시작합니다.