안녕하세요.
현재 10kb 정도의 플라스미드에 마지막 인서트 클로닝만을 앞둔 상태입니다. 염기서열 4kb 정도 되는 거대 단백질 발현 카세트인데요.
깁슨어셈블리로 두 조각을 붙여주고 Dh5a에 transformation 시켜 콜로니도 무난하게 얻어집니다.
: Transformation 이후 사용한 plate의 selection pressure 여부 확인합니다.
콜로니 피시알도 거의 대부분 Positive 입니다. (프라이머는 인서트에 하나, 백본 벡터에 하나 둡니다.)
: E.coli competent cell을 이용하여 colony PCR 결과를 확인합니다.
(현재 colony PCR primer set이 E.coli gDNA에 결합하여 증폭되는지 확인)
그런데 이제 문제는, positive 결과를 얻은 콜로니를 피킹해서 액체배지에 시딩해
: Selection pressure 여부 확인 필요합니다.
엑체배지에 접종하여 키운 뒤, 배양액을 희석하여 PCR 재확인 필요합니다. (현재 colony가 원하는 plasmid를 가진 E.coli 인지 확인)
overnight 배양 후 다음날 miniprep을 하는데요. 30개를 진행해도 30개 모두 agrose gel에 전기영동으로 내려주면 그 어떠한 밴드도 관찰할 수 없습니다.
: Miniprep 완료 후, DNA 정량을 수행합니다. (Kit 문제 확인)
전기영동 수행 시, loading dye와 섞어서 내렸는지 확인 필요합니다. DNA ladder는 loading dye와 섞어 사용하기에 문제가 없지만
Sample에 loading dye를 섞지 않으면, DNA가 가라않지 않고 위로 떠서 없어집니다.
positive control은 밴드가 잘 보입니다. . . 문제가 무엇일까요.... 정말 귀신이 곡할 노릇입니다.....ㅠㅠ
[정리]
1. Transformation 시점 사용한 plate의 selection pressure 여부 확인
2. Primer set specificity 확인
3. Colony identification
4. Miniprep kit 확인
5. Electrophoresis 조건 확인
