ELISA 하는데 샘플값이 계속 바딕입니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q ELISA 하는데 샘플값이 계속 바딕입니다.

레벨03 dbkorea (과기인)

26.08.26 19:33
조회389

abcam에서 나온 simple step elisa kit를 써봤습니다.

TNF-a에서는 스탠다드가 엉망이고 샘플이 blank랑 같은 수준으로 나왔습니다.

IL-10에서는 스탠다드는 아주 잘 나왔고 샘플이 또 blank랑 같은 수준으로 나왔습니다.

샘플은 rat serum이고 잘 분리되었습니다.

딥프리저에서 보관한 것을 사용 직전 녹여서 썼고, 제품 프로토콜에서 권장한대로 diluent에 25%로 희석한 것을 썼습니다.

그런데 안나와서 50%로도 해봤는데 값이 두배는 커녕 이전과 동일하게 blank랑 비슷한 값으로 나왔습니다. 이번에도 스탠다드는 잘 나왔구요.

TNF-a에서 스탠다드 엉망인 이유(프로토콜대로 했고, 제 프렙에는 문제는 없어보입니다. duplicate도 아주 잘 나왔어요)

그리고 TNF-a나 IL-10에서 샘플이 농도를 올려도 계속 바닥인 이유를 알고싶습니다.

무슨 문제일까요?

답답합니다...

Mol. Biol.-Protein > etc.

등록순
추천순

A 답변 4

레벨05 biotech25 (과기인)
26.08.26 22:53

일단은 standard가 잘 나오도록 하는게 좋겠습니다. TNF-a standard 엉망이라는 얘기는 값이 모두 낮게 나왔나요, 모두 높게 나왔나요, 아니면 직선성도 없고 엉망인가요?

TNF-a standard에서 duplicate가 되었다면 pipetting 실수 보다는 시약 반응이나 온도 문제 일 수 있습니다. 냉장고에서 막 꺼낸, sample diluent 나 standard 완충액을 상온에 충분한 시간 둔 후 좀 더 주의 깊게 희석을 해 보세요. TMB 반응시 5분 7분 10분 눈으로 계속 봐보세요. 색이 변할텐데요? 만약 값이 모두 높게 나왔다면, TMB 반응 시간을 좀 줄여보세요.

현재 rat serum이 염증 자극을 준 것인가요, 아니면 정상 serum인가요? 염증 자극이 충분해야 ELISA로 잡힐텐데요.

하나 test해 볼 것은 sample에 standard 단백질을 일정 농도 curve 로 섞어 ELISA해 보고 어떻게 나오는지 보세요. Standard 단백질 농도 만큼만 측정이 된다면 serum에 단백질이 없는 것이고, standard 만큼도 측정이 안 된다면 혈청 간섭이 아닌가 싶습니다.

답변리플

레벨01 실험하는그루트 (과기인)
26.08.27 09:30

제가 실험 할 때 기억이 나서 말씀드립니다.

먼저 저는 BD사의 ELISA kit를 사용했었습니다. 기본적으로 프로토콜에서 제시하는 스탠다드 적정값이 있지만, 팁프리저 보관과 여러 변수조건을 참고해서

sampling 후 희석배율을 설정하기 전에 꼭 serial dilution하여 (프로토콜에서 제시하는 희석 배율이 25%라면 원액 / 50% / 25% / 12%) 스탠다드 그래프에서 가운데 값에 걸리게끔 희석배율을 설정해서 사용했었습니다. 보통 control sample로 진행하면 어느정도 최대값을 알 수 있으니 거기에 맞게 흡광도 값과 tnf-a의 농도를 알 수 있어서 저렇게 진행했었습니다. 흡광도 값이 오버되거나 미달되어 blank되는 일이 없게하기 위해서요.

또한, 저도 당시 스탠다드 그래프 값이 낮게 나온 적이 있어 BD 사에 문의했었는데, 제품 문제였는지 기억이 잘 나지 않지만, 새로운 스탠다드를 보내줬었습니다.

만약 연구원님께서 같이 진행한 다른 지표의 ELISA 스탠다드 값에는 문제가 없다면 핸들링 문제는 아닐 것이며 (다른 연구원이 진행했을 때도 같은 상황이거나) 제품 사에 연락을 취해보는 것이 가장 빠를 것으로 예상됩니다.

sample은 원액과 serial dilution한 sample들은 비교해서 희석의 문제인지를 파악해보는 것이 좋을 것으로 예상됩니다.

답변리플

레벨05 오치 (과기인)
26.08.27 12:26

1. TNF-a

- standard가 엉망인것으로 보아, 전체적인 시험 과정 중 문제가 생긴 것 같습니다. (시험 진행 또는 보관중)

동일한 시약을 lab 내 다른 동료분께 standard만 test 해보고, 그래도 문제가 된다면 공급사(또는 제조사)에 문의하는게 가장 빠르게 조치할 수 있습니다.

2. IL-10

- st가 잘 나왔다고 하니, 시험과정 중 문제는 아닌 것으로 생각됩니다. 다만, IL-10인 경우 워낙 생성량이 적어, 보유하신 샘플에서 detection되기 힘들 수도 있습니다. 가능하다면, 이전에 잘 나온 sample로, 같은 kit를 이용하여 검증 시험을 진행하면 답이 나올 것 같습니다.

어떤 sample인지는 모르겠지만, 동일한 method로 진행한 다른 결과에서도 양상은 어땠는지 확인하는게 좋을 것 같습니다.

예) PCR, WB 결과 / 동물시험이라면 체중 확인 등