Western blot 현상화 시 well 간격 차이에 관하여 질문드립니다. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q Western blot 현상화 시 well 간격 차이에 관하여 질문드립니다.

레벨01 떵쿠노밀크샤워그아래만나 (대학원생)

26.08.03 17:37 (수정)
조회396

mouse hippocampus에서 단백질 발현량을 확인 중입니다.

어느 순간부터 다음 사진과 같이 sample 간의 길이가 달라지기 시작했습니다

lysis buffer의 문제인가 하여 바꾸어 보았으나 여전히 저러한 문제점이 발생하고 있는데 이유를 알 수가 없어 글을 작상합니다..ㅠㅠ

혹시 아시는 분 계실까요ㅠㅠ

Etc.

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A 답변 7

레벨05 SoliDeo (대학원생)
26.08.03 21:39

밴드의 전체적인 사진이 있으면 더 잘 판단할 것긴 하지만 우선..

가장 의심가는 것은 gel 제조 상태이고요.

electrophoresis 조건(전압, buffer 상태)에 문제가 없었는지 확인해보시길 권장드립니다.

답변리플

레벨01 떵쿠노밀크샤워그아래만나 (대학원생)
26.08.04 10:35
질문자

참고하여 진행해보도록 하겠습니다 도움 주셔서 감사합니다 !

레벨05 biotech25 (과기인)
26.08.03 22:16

Gel을 직접 만들어 사용하고 있나요? Gel을 충분히 굳힌 후 사용해 보세요. Stacking gel 만들 때, APS와 TEMED가 골고루 섞였는지 잘 확인해 보세요. 그리고 Gel 굳히고 comb을 뺄 때, 조심해서 부드럽게 빼 보세요. Well 아래 사이가 좀 찢어진게 아닌가 싶습니다. Well을 버퍼로 좀 닦은 후 loading 해 보세요. Well에 gel 찌꺼기나 기포가 남아 있었을 수 도 있습니다. 그리고, Well에 loading하는 시료의 부피는 모두 동일해야 합니다.

그리고, premade gel있으면 그걸로 해 보세요.

답변리플

레벨01 떵쿠노밀크샤워그아래만나 (대학원생)
26.08.04 10:36
질문자

Gel 제조의 문제가 맞는 것 같아, 참고하여 다시 진행해보려고 합니다 도움 주셔서 감사합니다 !

레벨02 fcsasgabha (과기인)
26.08.05 07:38 (수정)

뭔 젤탓을 해요?

젤 문제가 아닌 건 사진에 밴드가 우그러지지 않고 반듯하게 일렬로 잘 정렬되서 아닌거 딱 보이는구만.

샘플링할 때 그 샘플만 염 농도가 달라져서 그래요. 요즘 이런거 수업때 안 알려줘요? 선배들이 말 안해줘요?

그 샘플에만 처리하는 약물 때문일 수도 있고, 그 샘플만 유난히 다른 샘플들에 비해 농도가 다르게 나와서 샘플버퍼로 희석하면서 다른 애들이랑 차이가 나서 밀리는거에요. 샘플링 할 때 더 묽어지거나 진하지 않게 동일하게 샘플링 되도록 계산 신경쓰세요. 좁아진 레인의 샘플이 염 농도가 다른 애들보다 높은겁니다.