안녕하세요.

현재 단백질 정제에 난항을 겪고있는 초보 대학원생입니다,,

현재 BL21을 통해 재조합 protein을 제작하였고 his tag를 이용한 단백질 추출까지는 실험이 잘되는데요.. SDSPAGE를 통해 1 밴드 확인은 했습니다.

그런데 추출 시 사용하는 버퍼에 들어있는 이미다졸의 고농도를 제거하기 위해 Amicon centrifugal filter (10kDa)를 구매하여 농축을 진행하고 있습니다..타겟 단백질 크기는 50kDa 정도구요

현재 문제는 추출한 단백질의 농도가 매우 낮기 때문에 농축및 이미다졸 제거를 진행하고자 하였으나 amicon 필터에도 이미다졸 수용 농도가 100mM 이하더라구요 

그래서 버퍼로 이미다졸을 100mM까지 희석 후 500ul씩 나누어 여러번 농축을 진행하고 있는데 농축 후 단백질의 로스가 너무 심하게 관찰됩니다, 그래서 짧게 원심분리 후 파이펫팅도 진행해보았는데 제가 단백질을 측정하는 정량법이 브레드포드 정량법이라 단백질의 정확한 농도측정이 불가한것 같아 현재 BSA와의 intensity 비교를 SDSPAGE에서도 진행하고 있습니다. 그럼에도 불구하고 농축 후 단백질의 밴드가 확인되지 않는 이슈가 있습니다...
농축 시 사용하는 버퍼는 추후 실험에서 사용할 버퍼와 동일한 조건으로 진행하고자 하여 HEPES, NaCl, 0.001% tween-20을 사용하고 있습니다. twwen 20은 멤브레인흡착을 줄여주는 용도로 넣엇고 브레드포드 정량법에 영향을 줄 수 있어 수치를 매우 낮추어 사용했습니다.
14000g RPM으로 1분 돌려주고 파이펫팅하고를 반복하며 500ul 를 반복해서 넣어주었는데 여러번 농축을 한 튜브에 한것이 문제가 될지,, 어디서부터 잘못된 건지 트러블 슈팅이 전혀 안되어 고수님들에게 여쭤보고자 합니다,,
amicon 농축에 문제를 겪으셨던 분들이나 해결법을 알고 계신 고수님들 도와주세요 ㅜㅜ